磁性氧化铁纳米粒子在生物医学应用中的研究进展

朴美玉，赵经文

随着生物技术不断进步，利用新型功能纳米材料在医学领域来进行诊断、治疗已成为新的研究热点。20世纪80年代出现的磁性纳米粒子(magnetic nanoparticles，MNP)在生物医学方面呈现出良好的应用潜力。在已报道的各种磁性材料中，磁性氧化铁纳米粒子(iron oxide nanoparticles, IONPs)，特别是Fe3O4和γ-Fe2O3的制备及应用研究尤其受到关注。IONPs的磁响应性和生物相容性较好，毒性低，比表面积大以及饱和磁化强度高，在外加磁场作用下可控性好，制备过程相对简便，易于被功能化。因此IONPs可以成为蛋白质、低分子量试剂、离子、无机或有机污染物等物质的高效载体，并在磁共振造影成像、靶向药物运输及控制释放、磁性分离提纯、磁感应肿瘤热疗和靶向基因治疗等方面广泛应用[1]。本文在简要介绍磁性氧化铁纳米粒子的基本性质的基础上，对IONPs的在生物医药方面的最新研究进展进行综合评述。

1 IONPs的基本性质和制备

氧化铁系列化合物以不同的形式广泛存在于自然界中，常见的无水氧化铁系列化合物按晶体结构中铁离子的化合价来进行分类主要有三种。第一种氧化亚铁FeO，立方晶体结构中只有Fe2+，热力学不稳定，在室温下具有反铁磁性。第二种氧化铁Fe2O3，晶体结构中只有三价铁离子，但具有多态性，即其不同的晶体结构可以具有不同物理化学性质，有以下四种晶型：⑴α-Fe2O3，六方晶体结构；⑵β-Fe2O3，立方晶体结构；⑶γ-Fe2O3，反尖晶石结构的立方晶体结构；⑷ε-Fe2O3，正交晶系晶体结构。第三种是四氧化三铁Fe3O4，同时含有Fe2+和Fe3+的，反尖晶石结构的立方晶体结构。Fe3O4和γ-Fe2O3因其特有的磁性质，成为生物医学和生物技术应用方面的候选材料，与体相材料有明显差别[2]。在γ-Fe2O3或Fe3O4中用非铁离子置换晶体结构中的铁离子会改变它们的滞后参数(磁硬度)，从而改变其磁特性。另一方面，如果它们的纳米粒子大小在特定阈值之下(通常约10～15 nm)，会有自发磁化特性，磁矩呈任意取向，呈现超顺磁性，即无磁滞现象。

合成磁性粒子的路线主要有以下六类：共沉淀法、水热合成法、溶胶-凝胶合成法、流动注射合成法、超声波辅助法、高温分解法。此外，除了以溶剂和热分解为基础的合成方式，磁性粒子还可以通过生物体内趋磁细菌的生物矿化反应而得。新合成的MNP大都稳定性高、单分散性良好，但是具有疏水性，并且由于纳米粒子固有的表面效应和小尺寸效应，表面原子具有极强的活性，容易发生团聚等问题，导致磁特性消失，在体内会迅速被网状内皮系统吞噬。因此需对其进行表面改性使其稳定再应用于生物医学方面。常用的方法是构成核-壳结构，其磁性核心和表面化学性质决定它的功能和工作环境。一方面，通过调整磁性核心的性质(如化学组成)和晶格结构(如大小)等可以使纳米粒子有更强的磁响应。另一方面，通过壳表面包覆合适的功能化分子使磁性粒子在溶液中具有更好的性质：(1)提高稳定性和生物相容性，防止磁性粒子在血液等不利环境中降解；(2)抑制磁性粒子间的相互作用，增加分散性；(3)为连接的生物活性分子提供官能团，可结合和运输物质；(4)提高pH响应性，降低毒性等。壳表面通常由无机(二氧化硅、金、碳等)、有机表面活性剂(油酸钠、十二烷基苯磺酸钠等)或有机聚合物(聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乳酸等)通过表面化学修饰包覆。合成的无机或有机磁纳米复合物可以有更多的功能，甚至兼具治疗和诊断学性质，在两个领域都发挥作用。不同核-壳的磁性纳米粒子的大小从几纳米到几百纳米不等，并表现出不同的结构形状。单个颗粒大于50 nm为超顺磁性氧化铁纳米粒子(superparamgnetic iron oxide，SPIO)，4～13 nm为超小型超顺磁性氧化铁纳米粒子(ultrasmall superparamagnetic iron oxide，USPIO)，通常为半球形。从浓缩的氧化铁纳米粒子中获得的纳米簇要大得多(>50 nm)，也是半球形[3]。除了半球形，还有纳米管、四面体纳米粒子[4]、磁性纳米星[5]、纳米杆等形状。此外，磁性纳米粒子的化学性质不仅由它们的形状和大小决定，还受流体力学直径、溶剂分散性、表面电荷、胶体稳定性、对极端磁场的响应速度等影响。

2 IONPs的生物医学应用

2.1 磁共振成像 磁共振成像(MRI)已成为诊断组织病变，检测肿瘤的有效的方法之一。目前已经投入临床使用的造影剂多为纳米级别的磁性材料。SPIOs在保证安全性的前提下，在病灶组织内特异性分布较强，且起效浓度(nM级别)远低于钆类金属配合物，可以逃离单核吞噬细胞系统(MPS)。SPIOs可以明显改变磁性纳米颗粒附近的水分子的T2，提高图像的负反差。其对比性能受纳米粒子自身大小、亲水性、表面壳厚度影响。使用低分子量化合物共轭连接磁纳米颗粒可以使有效自旋从磁核心转移到周围的水中，从而提高水的弛豫效能。Wang等[6]报告使用聚乙二醇(PEG)单甲醚聚合脂质囊泡承载还原响应SPIO/阿霉素(DOX)(SPIO&DOX-PPLVs)作为一种新型的肿瘤磁共振成像诊断和药物递送控制治疗诊断系统。体外表征显示SPIO&DOX-PPLV具有纳米尺寸的结构(～80 nm)，优良的胶体稳定性，良好的生物相容性，以及相对高的T2弛豫(r2=213.82mM-1s-1)。体外细胞摄取研究和抗肿瘤研究显示SPIO和DOX-PPLV具有磁性靶向性质和有效的抗肿瘤活性。体内研究显示SPIO和DOX-PPLV具有优异的T2加权肿瘤靶向MRI能力，图像指导药物递送能力和高抗肿瘤效应。这些结果表明SPIO&DOX-PPLVs是用于MRI诊断和癌症治疗有前途的纳米载体。虽然超顺磁性氧化铁纳米粒子(SPIO)被认为是用于使用磁共振成像(MRI)体内跟踪干细胞的有前途的工具，但是它们的信号在注射细胞消失数周后仍然存在于心脏中。为了克服这个缺点，Mahmoudi等[7]使用磁-内胚层(ME)衍生的趋磁细菌标记人诱导多能干细胞衍生的心肌细胞(iPSC-derived cardiomyocytes, iCMs)。将ME-标记的iCMs注射到鼠心脏的梗塞区域，通过MRI和生物发光成像(BLI)进行探测，结果显示ME在细胞死亡的1周内清除。

2.2 靶向药物运输 靶向药物运输，尤其是抗肿瘤靶向给药是目前给药方式的研究热点。磁靶向药物(magnetic targeted drug delivery,MTDD)治疗是将药物先固定到MNP，然后注射载药MNP，利用外部永磁体产生的高梯度磁场引导粒子准确集中到所需部位。药物通过酶的活性或pH、渗透压和温度等的变化从磁性载体释放。最终提高靶区药物浓度降低对正常组织毒副作用，提高药效。磁靶向药物治疗效果受到粒子物理性质、用量浓度、结合药物类型、注射方式、靶组织的血管供应、外部磁场的几何形状、强度和持续时间等条件影响。患者的生理参数，如体重、血容量、心输出量、循环系统的外周阻力和器官功能，也会影响外部磁铁的效率。对于大多数的磁性载体，在靶区部位是200～700 mT磁场强度(磁通密度)与约8～100 T/mZ轴梯度。当磁场力超过线性血流速度(10 cm/s)或毛细管血流速度(0.05 cm/s)时，药物可截留在目标组织并被内皮细胞内吞。癌症组织和健康组织周围的物理环境在形态学上有很大不同，血管结构异常。被动靶向是指20～30 nm到100～150 nm的粒子，由于实质肿瘤的高通透高滞留效应(enhanced permeability and retention effect, EPR)，能选择性从血液外渗透到肿瘤间质的受损泄漏脉管，能逃脱肾脏清除，能够避免血浆蛋白吸附而被巨噬细胞吞噬，还能逃脱网状内皮系统的吞噬，最终被动靶向在癌症部位。相反，健康组织浓密的上皮细胞形成了高效屏障，可阻止磁纳米渗入。主动靶向给药是指，首先在超顺磁性粒子表面涂覆或修饰高分子物质后得到磁性纳米粒子、磁性微球(1～100 nm)、磁性纳米球(10～500 nm)或者磁性纳米囊，使其能结合药物活性分子。继而通过物理导向方法，如磁性导向系统控制，在高强度的外加磁场作用下，使药物聚集在靶部位；或者生物导向方法，在磁纳米表面修饰抗体等，将药物定向输送到治疗部位，最终通过酶、pH、温度等作用将释放于，实现主动靶向治疗，从而大大降低了常规治疗中药物对正常细胞的毒副作用。Peng等[8]构建了一种新型核壳结构Fe3O4@ZnO：Er(3+)，Yb(3+)@(β-CD)纳米粒子作为药物载体，在0.9%氯化钠溶液中，室温10min即可达到10%的承载率，并且随时间延长，承载率逐渐增加，最高可达到70%。这种载药的SPIONs在体内正常温度下稳定，当温度≥42 ℃时，药物会在90 min内迅速释放，故可利用微波辐射释放。同时细胞杀伤实验证明此种药物载体无细胞毒性，在载药后对MCF-7等癌细胞有明显的杀伤效果。He[9]发现SPIONs能够特异性靶向癌细胞，干扰癌细胞线粒体电子传递链，导致线粒体ROS形成，释放细胞色素C，诱导癌细胞凋亡。该发现有助于对纳米药物设计的安全性评价。因此在磁靶向药物运输方向上，研究主要着重于如何通过修饰磁性纳米粒子来提供药物代谢动力学、肿瘤选择性和个性化的治疗方案。

2.3 磁性分离提纯 高效分离细胞、蛋白质以及遗传物质(DNA、RNA)是临床上的重要步骤，MNP在生物分离提纯方面发挥的作用也愈发受到人们重视。将磁性载体置于溶液中后，溶液中的目的蛋白或细胞会吸附到载体表面，并在外加磁场的定向控制下实现物理分离。去掉磁场后，MNP可立即重新分散于溶液中。基于此方法可以直接从原样如血样、骨髓、组织匀浆、培养基等中将目的细胞或蛋白分离，操作简单快捷、过程温和、可重复利用，在生物分离与生物医学工程领域中具有独到的优势。Borlido等[10]发现MNP可用于通过抗体分离细胞，以及通过静电相互作用分离离子。研究结果证实，可通过多克隆抗体修饰的免疫磁珠分离人体CD4、CD8、CD19、CD34等细胞，分离效率达99.9%以上。Gadke等[11]将官能化的超顺磁性氧化铁纳米颗粒直接添加到巨大芽孢杆菌生长培养基上清中，孵育10 min后，>85%的重组蛋白A产物被吸附到颗粒上。使用手持式钕磁体磁性分离颗粒，并洗脱产物。0.5 g/L低的颗粒浓度即可有效的分离产物，且也不影响细菌的生长。在一步纯化中，蛋白A产物的纯度可以达到> 99.9%，故应用氧化铁纳米颗粒是一种很好的辅助分离手段。

2.4 磁致发热治疗 磁致发热治疗(magnetic fluid hyperthermia, MFH)是MNP和SPIO在生物医学方面的又一应用领域。由于肿瘤组织在高热下相比于正常组织散热困难，温度升温快，对热耐受性低于正常组织，因此热疗可以达到抗癌治疗效果。研究表明，利用外加磁场将磁性纳米粒子集中到肿瘤部位，再由外加交变磁场(alternating magnetic field, AMF)通过感应涡流、磁滞损耗或者奈尔松弛产生的发热效应，可使肿瘤组织升温至有效治疗温度(41～46 ℃)，从而使癌细胞发生凋亡和细胞程序性死亡[12]。周边正常组织由于没有产热介质不会受到升温影响，也不会受到损害，保证了热疗的安全性。Alvarez-Berríosd等[13]实验证明，在同样的条件下，磁性纳米粒子(MFH)诱导高热将比使用热水浴(HWH)的热疗更有效地增强蛋白酶体抑制剂硼替佐米(bortezomib,BZ)在BZ敏感性和BZ耐受性癌细胞中的细胞毒性。Arriortua等[14]设计一种新型的特异性靶向表达αVβ3受体的癌细胞的RGD肽缀合的MNP，这种纳米颗粒呈现出非常高的超顺磁性，对于磁性流体产生高于500 W/g的高热值。这些液体已经通过血管施用于大鼠，结果表明可降低肿瘤生存力。

上述说明磁性纳米材料是理想的磁致热疗试剂，而磁致发热治疗在比以往热疗方法更具优势，可成为恶性肿瘤治疗的新趋势。

2.5 基因治疗与诊断 磁性纳米粒子作为非病毒载体已开发应用于基因治疗。磁性纳米粒子介导基因传递系统，也称为磁转染。磁性纳米材料表面活性基团可通过静电吸引作用与质粒或目的基因DNA片段形成相应的复合物，并且保护基因，使其避免被核酸酶降解，也可被用来提供反义寡核苷酸和siRNA下调基因的表达。Voronina等[15]用聚乙烯亚胺/磁性纳米颗粒载体(PEI/MNP)，与直接PEI转染细胞比较，发现PEI/MNP复合物具有较高的效率。并且证明，若每个细胞仅载有0.37 pg铁，104个miR/PEI/MNP改造的磁响应细胞就可以被MRI检测出来。总之，他们的体外研究结果表明PEI/MNP作为磁性指导的血管生成调节的多功能工具是非常有前途的。Fernandes等[16]针对神经干细胞难以转染的问题，提出了MNP介导小环DNA的基因传递方法，这种方法转染效率高达54%，且基因的表达也可持续四个星期，更重要的是，神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞它都可以转染。这对神经干细胞的遗传工程应用具有很重大的意义。

2.6 生物毒性 已经发现纳米颗粒可通过呼吸途径进入人体，引起肺部病变。通过消化道进入的纳米颗粒，也有可能富集于肝脏、脾脏、肾脏等部位的网状内皮组织中。因此纳米颗粒的生物毒性也必须注意。通常认为纳米材料的毒性由大小、表面积、表面修饰、聚集状态等多种因素决定。总体而言，小于5 nm的磁性纳米粒子会很快被清除；水力学直径为5～8 nm(与30～50 kD血浆蛋白大小相近)并且低分子量的磁性纳米粒子可以经肾排泄。更大水力学直径的磁性纳米粒子，可被网状内皮组织(reticuloendothelial system，RES)在肝、脾处捕获[17]。此外，带正电或负电的磁纳米粒子也可与血浆蛋白相互作用，产生生物毒性。但是包覆有聚乙二醇、葡聚糖等亲水性衣壳的中性磁纳米粒子，不会与白蛋白、免疫球蛋白、纤连蛋白、补体等调理素蛋白发生相互作用。Lartigue等[18]提出，无表面修饰的磁纳米粒子的IC50接近0.5 mg/mL，而表面功能化磁纳米粒子具有更低的细胞毒性，与没有表面覆盖的粒子相比甚至可以称为无毒性。磁性纳米粒子的降解通常是由溶酶体降解完成的，同时释放铁离子。降解的动力学由三个因素决定，磁性纳米粒子表面是否可被酶识别、其表面聚合物具有亲水性以及粒子不能大量聚集在溶酶体中。铁离子的释放会促进细胞内氧化反应增强，而铁离子平衡是被体内酶系统高度调控的，过量的铁离子会被迅速储存在血清铁蛋白中，体内的酶系统会保持铁离子的水平。Jarockyte等[19]用NIH 3T3细胞检测SPIONs，发现其被定位在靠近细胞核的囊泡，而且其细胞毒性很低，在24 h细胞存活率接近95%，48 h细胞存活率仅有轻微降低。Li等[20]用壳聚糖/海藻酸包覆Fe3O4，发现其能特异性引起胃癌细胞系SGC7901/ADR死亡，检测下游基因LC3的表达，发现是由于细胞自噬引起的。Zhang等[21]研究发现，这种细胞自噬是由于Fe3O4能够损伤溶酶体，并导致LC3阳性自噬小体累积。而且Fe3O4会导致线粒体损伤，内质网/高尔基体应激。也就是说这种自噬的产生是多机制的，但若在Fe3O4表面包覆PLGA则会大大降低这种自噬。Remya等[22]也提出，右旋糖苷可以稳定IONs，使其不引起氧化应激，从而是生物安全的。但Joris[23]提出，单一细胞系是无法证明纳米颗粒的毒性的，因为不同的细胞系会有不同的响应，他提议应该建立一系列标准的细胞系用来筛选纳米颗粒的安全性。总的来说，磁性氧化铁纳米粒子与其他纳米粒子相比，生物毒性较小，但还有待进一步研究验证其安全性。

3 结语

自磁性纳米粒子出现以来，其在制备、改性、应用方面的发展迅速。磁性纳米粒子作为一种具有独特磁学性质的纳米材料，其在生物医学应用中表现出卓越性能和巨大的发展潜力，已逐渐成为国内外生物医学领域研究发展的热点。目前磁纳米材料在生物医学领域的临床应用还不成熟，面临着多重问题和挑战：制备具有更好稳定性、专一性和良好生物相容性的改性磁性纳米粒子；避免免疫系统大量消耗，提高病灶部位的磁性粒子富集率；如何提高靶向定位的精确度；如何降低其细胞毒性和使用剂量，减少对人体的不良反应；如何实现大规模批量生产及临床应用等。随着材料和生物医学的互助发展，必将促进对磁纳米材料的研发和应用，开发更有效应用于临床的复合功能材料。