蛋白组学在糖尿病肾病诊断及预测价值中的应用

魏静，李海霞，哈小琴

·综述·

蛋白组学在糖尿病肾病诊断及预测价值中的应用

魏静，李海霞，哈小琴

730030 兰州，甘肃中医药大学临床医学院（魏静、哈小琴）；730050 兰州，中国人民解放军联勤保障部队第九四〇医院检验科（魏静、李海霞）；730000 兰州大学公共卫生学院（李海霞）

据统计，有 30% ~ 40% 的 2 型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）患者会发展成为肾病（diabetic nephropathy，DN），其中有一半 DN 患者会发展为终末期肾脏疾病，需要进行透析或移植治疗[1]。DN 分为三个阶段：微量白蛋白尿、临床糖尿病肾病和终末期肾损害。微量白蛋白尿可用于糖尿病肾脏损害的早期检测，在初期肾病阶段进行干预可有效防止进展为终末期肾损害。但是当患者体内出现微量白蛋白尿时，肾脏组织已经发生了一些结构破坏。此外，许多晚期肾脏组织病理学改变的患者显示正常白蛋白尿[2]。蛋白组学是对特定组织、不同细胞或机体体液中表达的蛋白质的整体研究。通过找到健康受试者与具特定病理改变患者之间的差异蛋白点，可用于识别疾病的特定诊断或预后生物标志物[3]。本文就通过蛋白组学技术在 DN 中诊断、预测等方面的作用作一综述。

1 蛋白组学

蛋白组学即对生物样品中表达的蛋白质进行总体分析，更深入地研究包括检测蛋白质的翻译后修饰、蛋白质-蛋白质相互作用等。质谱法通常与前期色谱分离技术，如液相色谱（liquid chromatography，LC）和毛细管电泳（capillary electrophoresis，CE）相结合，是研究蛋白组学的主要工具[4]。蛋白组学技术包括双向凝胶电泳（two-dimensional gel electrophoresis，2-DE）、表面增强激光解吸/电离、液相色谱-质谱（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）和毛细管电泳-质谱（capillary electrophoresis-mass spectrometry，CE-MS）等[5]。蛋白组学不仅被广泛用于发现新的生物标志物，而且还可以更好地了解疾病（例如糖尿病、癌症、阿尔茨海默病和肾脏疾病）的潜在机制，因为该技术能够检测识别细胞和生物样品中的蛋白质表达水平[6]。由于生物样本中蛋白质之间的生化特性和稳定性有所不同，蛋白组学的研究面临着多重挑战，例如蛋白质的浓度范围很宽，蛋白组学检测技术取决于样品的制备、蛋白质的初始分离，难以量化低丰度的尿标志物及个体之间尿蛋白排泄的巨大差异[7]。尽管蛋白组学的发展存在一定的挑战，但其对于疾病的诊断、预后及治疗靶点的研究仍然具有重要价值。

2 尿蛋白组学在糖尿病肾病中的应用

寻找早期糖尿病肾病的标记物成为目前的研究热点。对于肾脏疾病的研究，尿蛋白组学已得到迅速发展并广泛应用于肾脏损害的早期诊断和鉴别，具有无创、简便、可大量获取的优点[8]。与其他生物液体相比，尿液中包含从全身到局部组织的细胞外囊泡、蛋白质和小分子物质。然而，高丰度蛋白（如白蛋白，占总蛋白量的 25%）仍是尿蛋白组学研究的障碍，因为它可能掩盖了低丰度的蛋白质[9]。同时，尿液也是直接反映肾脏的非侵入性物质。因此，尿蛋白组学的研究对于肾脏疾病具有重要的意义[10]。

等压标记进行相对和绝对定量（isobaric tags for relative and absolute quantification，iTRAQ）不仅对鉴定蛋白的数量和种类有优势，而且组织、细胞、体液等均可作为检测样本，便于探索疾病发生机制和筛选标志物。有研究通过使用 iTRAQ 及无标记蛋白组学，以鉴定与肾病相关的潜在尿蛋白标记物并通过酶联免疫吸附测定进行交叉验证。总共通过 iTRAQ 和无标记蛋白组学分析分别鉴定出 341 和 396 种蛋白质，发现触珠蛋白（haptoglobin，HPT）可以作为肾病相关的候选生物标志物，用于区分健康个体和肾病患者以及糖尿病患者的标志物，具有最高的识别能力。因此，HPT 与肌酐之比（HPT-to-creatinine ratio，HCR）被评估为早期肾功能下降（early renal functional decline，ERFD）的独立预测因子。这些数据表明，HCR 可能是比尿微量白蛋白更敏感的生物标志物，可以用作肾功能下降的早期检测指标，同时也是台湾糖尿病患者中与 ERFD 相关的标志物[11]。

动力蛋白在 DN 的发生及发展过程中起到重要作用。它可通过促使线粒体的分裂、加剧氧化损伤和细胞凋亡，造成肾小管上皮细胞受损。另一方面，动力蛋白还可以引起足细胞的损伤。有研究发现采用蛋白组学 2-DE 和质谱技术发现动力蛋白在气阴两虚证中高表达、肝肾阴虚证中低表达、在脾肾阳虚证中不表达，表明氧化应激损伤在气阴两虚证中较为明显[12]。

Lindhardt 等[13]通过 CE-MS 在慢性肾脏疾病（chronic kidney disease，CKD）患者尿样中发现了尿液生物标记物，称为 CKD273 分类器，并在几个 CKD 队列中得到验证。Schanstra 等[14]对 T2DM 患者进行随访，主要考察患者从正常蛋白尿到微量蛋白尿以及到大量蛋白尿的改变。研究发现 CKD273 分类器对预测 DN 进展比蛋白尿和 eGFR 的水平更具价值。

Betz 等[15]通过慢性高血糖和高血压肾损害大鼠模型来模拟 DN，通过尿蛋白组学分析发现，DN 大鼠尿液中有 297 种多肽表达增加、15 个多肽表达减少。研究发现大鼠尿表皮生长因子（urinary epidermal growth factor，uEGF）表达较对照组少。同时，在肾功能正常的 T2DM 患者中研究发现，uEGF 与肌酐比值的降低和正常量蛋白尿 T2DM 患者肾功能的下降密切相关，提示 uEGF 与肌酐比值可能是预测 DN 发生的新型尿液标志物。

3 血浆及血清蛋白组学在糖尿病肾病中的应用

除了尿液外，血浆也被广泛应用于研究各种疾病的生物标志物[16]。然而，血液中的蛋白组学由于采样后的可变性而难以检测，并且许多高丰度的蛋白质，例如免疫球蛋白、白蛋白可以掩盖低丰度的潜在生物标记物。因此，早期的血浆蛋白组学研究并未显示出探讨生物标志物的能力，因为循环肽可能反映的不仅仅局限于肾脏的一般病变过程。但是，蛋白组学的进步正在推动这一领域的发展[17]。

有研究首次使用蛋白组学 iTRAQ 技术通过 Q-Exactive质谱仪鉴定早期糖尿病肾病中差异表达的血浆蛋白；结果发现，与对照组相比，实验组共鉴定出 57 种蛋白质，其中上调 32 种、下调 25 种。同时，通过 ROC 分析和蛋白印迹技术证实了明胶蛋白、胶凝素-11、PTPRJ 和 AKAP-7 蛋白是早期糖尿病肾病的候选生物标志物[18]。

国内学者通过应用血清蛋白组学技术筛选 III ~ IV 期 DN 患者气阴两虚证的差异蛋白，研究发现所鉴定出的差异蛋白质质核比大多在 1000 ~ 20000 Da 的肽段内，从而为临床应用 DN 气阴两虚证的研究提供客观参考依据，从中医的角度为 DN 的研究提供新的思路[19]。

4 组织蛋白组学

组织蛋白组学的研究对病理生理的研究具有重要意义。在临床中肾活检并不作为 DN 患者的常规检查，而且经活检分离的肾小球数量少，因此肾组织蛋白组学研究少有报道。人体肾脏组织不容易获得，目前组织蛋白组学的研究在动物模型中应用较多。

衰老标志物蛋白-30（senescence marker protein-30，SMP-30）是一种多功能蛋白，与细胞稳态、抗坏血酸的生物合成和氧化应激调节有关，同时也与 β 细胞功能有关。此外，SMP-30 的缺乏会影响胰岛素分泌[20]。有研究通过二维差异凝胶电泳（2-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis，2D-DIGE）和质谱对早期 DN 大鼠模型的肾组织蛋白组学进行了差异分析，发现与健康对照组相比，DN 组 SMP-30 在肾组织中的表达明显下调，对照组和 DN 大鼠尿中分离的外泌体也有相同的趋势，并在人体中得到验证。表明 SMP-30 对于 DN 的诊断具有重要价值[21]。

5 肾小球蛋白组学

DN 由多种因素导致，包括葡萄糖代谢紊乱、氧化应激、肾血液动力学的改变和遗传倾向等。为了更全面地了解 DN 的发病机制，现已将各种蛋白组学应用于病理生理研究。通过使用 2D-DIGE 和基质辅助激光解吸/电离飞行时间（MALDI-TOF）质谱分析，观察了早期 DN 肾小球蛋白的变化。研究发现在 KKAy 小鼠和 C57BL/6 小鼠之间获得了 19 种差异表达的肾小球蛋白。KKAy 小鼠中有 17 种上调，有 2 种下调，其中包括抑制素和膜联蛋白 A2 的上调。抑制素可能与膜联蛋白 A2 相互作用并受 Ca2+依赖性方式的调节[22]。有研究认为抑制素可能是治疗与氧化应激增加和线粒体功能障碍有关的疾病的潜在治疗靶点，例如胰岛素抵抗、T2DM、肥胖症和癌症等[23]。因此，对抑制素和膜联蛋白 A2 的进一步研究可能会为 DN 的发病机制提供新的见解。从长远来看，来自单个肾小球的综合数据可以用来精确定位肾脏疾病动物模型或蛋白尿和肾小球疾病患者的新靶点。

有研究对有较长的糖尿病病史却不出现 DN 的患者和 DN 患者的肾小球进行蛋白组学分析，结果发现没有发展为 DN 患者肾小球中丙酮酸激酶 M2 的表达和活性上调。丙酮酸激酶 M2 激活可以通过增加葡萄糖代谢流出，抑制毒性葡萄糖代谢产物的产生以及诱导线粒体生物合成以恢复线粒体功能从而保护肾脏[24]。

6 小结与展望

目前 DN 尿液蛋白组学研究已有所收获，发现了一些对于 DN 鉴定具有潜在临床诊断价值的标志物，如触珠蛋白、动力蛋白及 uEGF 等蛋白。蛋白组学研究仍然处于初级阶段，虽然蛋白组学已经在寻找早期 DN 标志物方面取得一些成就，但几乎所有研究结果均处于基础研究阶段，还没有完全应用到临床，同时目前还没有出现一个可以代替尿白蛋白排泄率的尿蛋白组学的生物标志物。然而，随着蛋白组学技术和生物信息学的不断发展，未来我们很可能通过分析尿液、血清、肾组织的蛋白组学变化获得足够的生物信息，通过生物信息学技术建立 DN 蛋白质组数据库，从而进一步探讨 DM 患者发生肾损害的机制、筛选特异的诊断标志物等，给出针对性的预防和治疗方案。同时未来的研究应侧重于结合基因组、转录组、表观遗传学组和代谢组学的系统生物学研究，有望为 DN 患者的早期诊断、早期干预和精准治疗带来新依据和新策略。

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国家自然基金（81273568）

哈小琴，Email：haxiaoqin2013@163.com

2020-02-06

10.3969/j.issn.1673-713X.2020.04.017