实时荧光聚合酶链式反应技术在慢性乙型肝炎患者血清标本HBV DNA定量检测中的应用价值

张宁

(南阳市第二人民医院 检验科，河南 南阳 473000)

慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)是常见传染性疾病之一。据统计，CHB每年致100万人死亡[1]。因此，临床需加强CHB早期筛查，并动态监测病情变化，以针对性干预治疗，抑制病情进展。肝活检是临床诊断和评估肝脏疾病的金标准，但其为介入性操作，存在一定创伤，可重复性差。HBV DNA能直接、客观地反映HBV感染、复制活性，而荧光聚合酶链式反应(fluorescent quantitative PCR，FQ-PCR)技术在密闭环境内进行，无需电泳，借助计算机自动定量分析，操作简单，且能避免标本污染。研究表明，在血液筛查中，FQ-PCR技术能提高HBsAg阴性低浓度HBV感染者的检出率[2]。本研究旨在探讨实时FQ-PCR技术在CHB患者血清标本HBV DNA定量检测中的应用价值，具体如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2015年4月至2018年6月南阳市第二人民医院收治的109例CHB患者作为研究组，同期81例HBV早期感染者作为对照组。研究组：男71例，女38例，年龄26～57岁，平均(41.48±6.13)岁，体质量指数18.4～26.8 kg·m-2，平均(22.71±1.35)kg·m-2。对照组：男52例，女29例，年龄24～59岁，平均(42.08±5.97)岁，体质量指数18.2～26.7 kg·m-2，平均(22.69±1.29)kg·m-2。两组年龄、性别、体质量指数差异无统计学意义(P>0.05)。本研究经医院医学伦理委员会审批通过。

1.2 纳入及排除标准(1)纳入标准：①初次确诊；②入组前6个月内未经抗HBV治疗；③签署同意书。(2)排除标准：①丙型、甲型等其他类型肝炎；②自身免疫性疾病。

1.3 治疗方法指导合理饮食、规律生活、适宜运动，拉米夫定(中孚药业股份有限公司，国药准字H20133056)，口服，每次300 mg，每日1次。

1.4 检测方法

1.4.1HBV DNA 以实时FQ-PCR技术测定HBV DNA。所需试剂盒、试剂由深圳匹基生物工程股份有限公司提供，FQ-PCR检测仪由美国罗氏公司提供。晨空腹以非抗凝管取静脉血3 mL，采取PEG沉淀法提取血清样品，加热裂解，取提取液2 μL做模板，依次以92 ℃、5 s，60 ℃、30 s，37 ℃、60 s，做40个循环，延伸结束，测F1通道荧光强度，反应结束，采用FQ-PCR检测仪自带软件绘制标准曲线，计算样品检测结果。血清HBV DNA阳性：HBV DNA水平≥5×102copies·mL-1。检测结果采用绝对值的对数值进行比较分析，实验设临界值、阴性、强阳性各1孔作为内标对照，同时采取5×107、5×106、5×105、5×104copies·mL-1阳性标准作为外标。

1.4.2HBV DNA变异 向PCR反应混合液内加荧光标记寡核苷酸探针，以荧光循环技术记录荧光杂交探针溶解温度，测HBV DNA变异情况。操作由相同资深专科医生严格按规范完成。

1.5 统计学处理采用SPSS 21.0统计软件处理数据，计数资料以频数和率(%)表示，组间比较采用χ2检验，等级资料采用Ridit检验，计量资料采取Kolmogorov-Smirnov正态性检验与Bartlett方差齐性检验，均确认近似服从正态分布且方差齐性，以均数±标准差描述，两组间比较采用独立样本t检验，组内比较采用配对t检验，多组间比较采用单因素方差分析，多重比较采用LSD-t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 入院首次两组HBV DNA表达水平入院首次检测，研究组HBV DNA表达水平为(7.21±1.03)copies·mL-1，对照组HBV DNA表达水平为(3.49±1.28)copies·mL-1。研究组HBV DNA表达水平高于对照组，差异有统计学意义(t=22.184，P<0.001)。

2.2 研究组HBV DNA表达水平治疗前HBV DNA表达水平为(7.21±1.03)copies·mL-1，治疗后3个月HBV DNA表达水平为(3.49±0.98)copies·mL-1，治疗后6个月HBV DNA表达水平为(2.81±0.76)copies·mL-1，治疗后9个月HBV DNA表达水平为(2.79±0.80)copies·mL-1。经单因素方差分析，治疗后3、6、9个月HBV DNA表达水平对比，差异有统计学意义(F=602.257，P<0.001)；两两对比，治疗后6、9个月HBV DNA表达水平低于治疗后3个月，治疗后3个月低于治疗前，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.3 研究组HBV DNA变异率治疗前研究组HBV DNA变异率为0，治疗后3个月研究组HBV DNA变异率为0，治疗后6个月为11.93%(13/109)，治疗后9个月为20.18%(22/109)，不同时间点比较，差异有统计学意义(F=43.087，P<0.001)。治疗后 9个月HBV DNA变异率高于治疗后6个月，治疗后6个月高于治疗后3个月、治疗前，差异有统计学意义(P<0.05)。

3 讨论

我国属于CHB高发地区，全国约1.3亿HBV携带者，其中3 000万以上为需积极治疗现症感染者。HBV感染后表现复杂，单纯血清标志物检测难以准确评估病毒复制活性，而外周血HBV DNA是病毒感染后复制最可靠、最直接的指标，但常规PCR法操作复杂，污染物多，假阳性率较高，致使HBV DNA检测临床应用受限[3-4]。

FQ-PCR是近年发展起来的一种新型PCR技术，其融合分子杂交、基因扩增、荧光物理技术于一个整体，在封闭条件下实施基因扩增、产物分析，同时借助微机控制实现自动分析及实时监测，可补充常规PCR技术无法定量、易污染等弊端[5]。研究显示，FQ-PCR法检测HBV DNA能真实反映HBV感染及复制状态，对CHB临床诊断、治疗方案制定、预后评估具有重要指导意义[6]。本研究显示，入院首次检测研究组HBV DNA表达水平高于对照组，与上述研究结论近似。此外，本研究采取FQ-PCR技术动态监测CHB患者治疗前、治疗中HBV DNA表达水平，结果显示，治疗后6、9个月HBV DNA表达水平低于治疗后3个月，治疗后3个月低于治疗前，提示系统性治疗中FQ-PCR技术可实时反映病毒复制活性，可为临床预后评估提供参考依据。有研究报道，CHB患者经系统治疗6个月以后，外周血HBV DNA表达水平未继续降低，甚至有再次升高情况[7-8]。这与本研究拉米夫定治疗6、9个月后血清HBV DNA水平无变化的结果一致。拉米夫定是一种新型强效抑制HBV复制核苷类药物，具有服用方便、耐受性好等特点，相关研究表明，抗病毒治疗中HBV会激活自身免疫逃逸机制，酪氨酸-蛋氨酸-天冬氨酸-天门冬氨酸基因序列出现突变，对抗机体免疫攻击行为，出现耐药性，一旦出现耐药性，拉米夫定不再敏感，可能会伴肝功能异常、HBV DNA定量反跳等情况[9-11]。因此，临床在准确评估HBV DNA复制活性的同时还需积极了解HBV变异性。本研究进一步对比发现，治疗后9个月HBV DNA变异率高于治疗后6个月，治疗后6个月高于治疗后3个月、治疗前，由此可知，随着治疗周期的延长，HBV DNA变异率呈升高趋势，实时FQ-PCR技术能同时了解HBV DNA变异性，对临床合理用药，调整治疗方案和进一步提高治疗效果具有积极意义。

综上可知，实时FQ-PCR技术检测血清标本HBV DNA水平可客观反映HBV感染、复制活性，可为临床诊断、疗效评估提供数据支持。