人乳头瘤病毒疫苗的应用及研究进展

尤淑文 叶菁 吕卫国

宫颈癌是目前唯一病因明确，可预防可筛查的肿瘤。基于一级预防策略，目前预防性人乳头瘤病毒（human papilloma virus,HPV）疫苗已逐渐普及，可有效预防大部分宫颈癌及生殖器疣。同时，随着宫颈癌筛查技术的成熟及普及，越来越多的HPV感染状态被发现，二级预防——治疗性疫苗的研发也成为热点。治疗性疫苗可介导有效的细胞免疫，产生病毒特异的细胞毒T细胞，杀死HPV感染的细胞，逆转HPV诱导的相关组织损伤，从而降低宫颈癌的发生率及病死率。本文现针对预防性及治疗性HPV疫苗的机制、种类及目前存在的问题等研究进展作一综述。

1 HPV预防性疫苗

1.1 疫苗应用效果 目前，中国食品及药品管理局已批准上市了3种预防性HPV疫苗，分别是2价疫苗、4价疫苗和9价疫苗。这3种疫苗均覆盖HPV16和18这两种亚型，4价疫苗还可预防约90%与HPV6、11相关的肛门、生殖器疣。9价在4价疫苗的基础上，增加了对31、33、45、52、58型 HPV 的预防，即 9价 HPV 疫苗可预防约90%的宫颈癌及90%的肛门、生殖器疣[1-2]。

有研究表明，接种9价HPV疫苗的人群5年后仍可检测到持续性HPV抗体应答，并证明其抗体应答是持久的[3]。而接种4价疫苗6年后，14～19岁女性的4价疫苗相关HPV感染率下降了64%[4]。另一项研究发现，接种4价HPV疫苗的女性在10年的随访中均未检查出与HPV 16、18型相关的高级别宫颈上皮内病变（cervical intraepithelial neoplasia 2/3，CIN 2/3），证明 4 价疫苗可持续提供至少10年的保护作用，其效力至少在10年内保持在90%以上[5]。一项长达9.4年的随访研究表明，接种2价疫苗3年后，接种人群中没有发生HPV16、18感染及其相关的癌前病变及癌变，并且接种人群的HPV抗体滴度在9年后仍保持高水平状态[6]。

1.2 疫苗接种实施方案 临床研究提示，年龄＜15岁及年龄≥15岁的女性分别接受2剂及3剂HPV疫苗，其抗体滴度无显著差异。因此世界卫生组织（World Health Organization，WHO）在 2015年对 HPV 疫苗（包括2、4、9价疫苗）剂量实施方案进行修订，将＜15岁女性的3剂HPV疫苗方案改为2剂，但≥15岁女性仍推荐3剂方案[7]。使用上述疫苗实施方案可有效降低疫苗成本并提高覆盖率[8]。

随着疫苗研究不断进展，9价疫苗已经被证实可预防的HPV范围更广，接种过2价或4价疫苗的个体可继续接种9价疫苗巩固、增强疫苗保护作用。注射4价或2价疫苗未满3剂者，补注射9价疫苗至满3剂，其抗体滴度水平以及新增加的亚型产生的抗体水平同样具有保护效力。完成2价或4价疫苗的3剂接种计划后再接种9价疫苗可以使抗体滴度达到一个较高并且稳定的水平[9]。

1.3 注射HPV预防性疫苗人群的宫颈癌筛查方案接种预防性HPV疫苗并不能取代常规宫颈癌筛查，因为现有的预防性疫苗并不能覆盖所有HPV致癌型别。此外，不是所有人群都能在指定的年龄阶段进行疫苗接种，故无法确认在接种疫苗前是否已接触过高危型HPV[10]，且不是所有人均在规定时间内完成接种计划[11]。故无论是否接种过HPV疫苗，均有进行定期筛查的必要性。2018年美国预防服务工作组（United States Preventive Services Task Force，USPSTF）仍推荐 21～29 岁女性每3年进行一次宫颈细胞学检查，30～65岁女性每3年进行一次宫颈细胞学检查，或每5年进行一次HPV检查联合宫颈细胞学检查以筛查宫颈癌[12]。

2 HPV治疗性疫苗的研究进展

治疗性疫苗不同于预防性疫苗，其可诱导产生细胞免疫应答，并对HPV感染诱导的宫颈损伤及癌症产生治疗作用。

2.1 治疗性疫苗的临床意义 首先，预防性疫苗的普及受到一定的限制。至2016年末，虽有70个国家已将预防性疫苗列入国家免疫规划[13]，但预防性疫苗的应用主要集中在发达国家，欠发达国家的应用率仅8%[14]，而欠发达国家才是宫颈癌，肛门、生殖器疣高发地区。其次，预防性疫苗无法消除已经存在的感染及已经形成的损伤，故预防性疫苗没有治疗效果。目前清除已感染细胞的有效途径为治疗性疫苗诱导的细胞免疫[6，15]。

目前临床中对宫颈病变的主要治疗方法为物理方法切除，但切除术对机体损伤大且易复发。故研发HPV治疗性疫苗迫在眉睫，以干预HPV感染所致的低级别病变的进展、诱导现有病变的消退、预防治疗后复发。

2.2 治疗性疫苗的作用机制 病原体穿透机体上皮或黏膜屏障时，病毒衣壳中的病原体相关分子（pathogen associated molecular pattern,PAMPs）被病原体识别受体（pathogen recognition receptor,PRRs）识别。PRRs的激活促使抗原提呈细胞（antigen presenting cell，APCs）流入感染部位并吞噬抗原，其后携带抗原迁移到淋巴结，进一步激活T细胞，启动适应性免疫应答。激活的T细胞增殖分化为效应T细胞，可直接消灭病毒感染的细胞。同时，IL-10等细胞因子促进B细胞的增殖与分化，产生抗体，以应对细胞外病原体。

HPV 基因组编码的 7 个早期蛋白（E1、E2、E4、E5、E6、E7、E8）和 2 个晚期蛋白（L1、L2），均可成为疫苗的抗原靶点。其中，L1、L2编码病毒衣壳蛋白，于早期感染基底层上皮细胞时起作用；E1、E2参与HPV病毒在宿主细胞内复制增殖。由于该4种蛋白发生于病毒生命周期早期，故可成为疾病早期的治疗靶点[16-17]。E6、E7可调控宿主细胞周期，促进肿瘤的发生，两者仅存在于HPV诱导的癌前病变及癌变的组织中，故可成为HPV诱导的癌前病变及癌变的免疫治疗的理想靶点。

2.3 治疗性疫苗的种类 将靶点抗原的相关遗传物质呈递至APCs，并诱导细胞免疫反应，从而清除损伤及增殖异常的细胞组织是治疗性疫苗的主要研究方向。寻找有效的抗原呈递载体是治疗性疫苗治疗效果的关键。

2.3.1 以核酸为载体的治疗性疫苗 DNA载体疫苗是将携带抗原相关DNA的质粒转染至宿主组织细胞中，使其表达抗原相关蛋白，诱导细胞免疫反应，从而起到治疗疾病的目的。DNA作为载体的优势在于构造简单、成本低，热稳定性较强，因缺乏抗载体免疫反应，故其可重复给药，同时诱导体液免疫及细胞免疫，具有良好的安全性及耐受性[18]。目前包含HPV16、18的E6、E7基因片段的DNA载体疫苗VGX-3100，已于2015年进入Ⅱ期临床试验，联合化疗应用于167位宫颈癌患者，显示出较好的治疗效果，Ⅲ期临床试验正在进行中[19]。

2.3.2 以病毒为载体的治疗性疫苗 由于病毒具有将自己遗传物质转至宿主细胞并进行复制的能力，故将病毒非重要基因转换成目标抗原基因，可将抗原基因转染至宿主细胞，转录并翻译成免疫原性蛋白，从而诱导特异性免疫反应的发生，起到治疗目的。目前研究较为广泛的是腺病毒、腺相关病毒及痘病毒。痘病毒相比于腺病毒，其遗传物质更多、更稳定，故可携带、支持并表达更多的转入基因[20]。36例CIN1-CIN3患者进行包含HPV E2基因的痘病毒疫苗Ⅰ/Ⅱ期临床试验后，34例痊愈，2例CIN3转归至CIN1[21]。进一步对1 176例女性患者及180例男性患者进行Ⅲ期临床试验，89.3%的女性患者及55.5%的男性患者痊愈[22]。

2.3.3 以细菌为载体的治疗性疫苗 减毒活菌载体疫苗可有效诱导黏膜、体液、细胞免疫反应，疫苗注射后，即被APCs吞噬并有效诱导体液及细胞免疫[23]。最常用减毒活菌为单核细胞增多性李斯特菌（Listeria monocytogenes，Lm），Lm被吞噬细胞吞噬后，分泌膜活性毒力因子LLO和磷脂酶C，降解囊泡，进入吞噬细胞细胞质中并转录、翻译目标蛋白，并通过内源性抗原处理途径激活CD4+及CD8+T细胞，从而诱导特异性免疫反应[24]。酵母菌相关疫苗同样为研究热点，重组HPV-16 L1酵母株可产生食用型HPV疫苗，在小鼠身上已得到较好应用效果。将编码优化的HPV-16 L1基因克隆至酵母细胞中，采用层析法纯化酵母提取物中的L1蛋白，免疫电子显微镜显示，合成的蛋白含有天然构象表位，具有巨大潜力[25]。以细菌及真菌为载体的治疗性疫苗的优势在于制备成本低，安全性较高，应用后一旦出现不良反应，可立即通过使用抗生素等药物对其进行清除。

2.3.4 以多肽为载体的治疗性疫苗 哺乳动物针对HPV的细胞免疫是由携带E6或E7起始表位的肽段诱导产生[26]，以多肽为载体的治疗性疫苗的优势在于安全、稳定、可大批量生产[27]。合成长肽（＞20个氨基酸）被用于载体，其经过APCs加工及呈递后，可诱导特异性免疫反应。多肽疫苗免疫原性较低，联合应用PepCan等免疫佐剂可有效提高其免疫原性。多肽疫苗ISA101的Ⅰ期临床试验中，47%患者病变部位组织学恢复正常，Ⅱ期临床试验中30%患者痊愈，且2年内无复发[28]。

2.4 治疗性疫苗研发中存在的问题 治疗性疫苗虽然具有较好的应用前景，但目前大多仍处于临床前及临床研究阶段。几种取得进展的疫苗也存在较明显的缺陷。比如DNA载体疫苗注射后，体细胞对DNA的摄取率较低，导致大部分DNA滞留在细胞外[29]。以及疫苗肌肉注射后，质粒进入并转染肌细胞，然而肌细胞不属于APCs，无法形成较强的特异性免疫反应，导致效果不佳。病毒载体疫苗的主要问题在于所应用的病毒多为常见病毒，如60%的成年人体内含有高滴度腺病毒抗体[30]，导致腺病毒载体无法进入靶细胞，从而无法达到预期的治疗效果。

3 展望

目前应用于临床的预防性HPV疫苗已取得较好应用效果，9价HPV疫苗对宫颈癌的预防达到90%，各个国家也在努力提高疫苗接种率。相比较而言，治疗性疫苗目前还处于研究阶段，存在疫苗中抗原摄取率低、诱导细胞免疫原性低等问题。研究人员正在尝试通过改变局部免疫调节、改变载体密码子、检查点阻断、局部组织细胞膜电穿孔以及联合应用化疗药物等方法改善缺陷。我们相信治疗性疫苗将会更广泛应用于临床，预防性疫苗联合治疗性疫苗，可更加全面保护患者免受HPV诱导的宫颈癌等疾病的困扰。