核酸适配体在肺腺癌诊断和治疗中的应用现状及研究进展

李名一，姜良勇，高 川，刘媛媛

(1.佳木斯大学附属第一医院肿瘤科，黑龙江 佳木斯 154004；2.佳木斯大学，黑龙江 佳木斯 154007)

20世纪末，单克隆抗体(mAb)技术的出现给医学攻克癌症带来了希望。但是它并没有达到预期效果，之后随及出现了一种使生物分子特异性结合的技术，它就是我们现在所熟知的适配体，aptamer(适配体)来源于拉丁语“aptus”，意思是“西服”，希腊语后缀“meros”意为“部分”，这说明适配体具有与特定目标进行互动的潜力。是最早由Ellington等[1]和Tuerk等在1990年提出，核酸适配体是从一种人工合成的寡核苷酸文库中筛选得到单链寡核苷酸， 可以是单链 DNA， 也可以是RNA[2]。分子量约为10 ～ 30 kDa，明显小于抗体。DNA相对而言，它在体外会更稳定。可以通过三维互补，不是碱基配对，来识别目标，并与目标结合，特异性和亲和力高，有或几乎没有免疫原性，不会引起免疫排斥反应[3]。同样它们也被叫做"核酸抗体"。迄今为止，适配体已经应用于很多的生物和医学领域，从生物成像、疾病诊断、靶向治疗以及给药。它们在临床和实验室环境中显示出非常大的潜力。它是一种短小的单链寡核苷酸，可以折叠成独特的3D结构。适配体，它是通过一种被称为"指数富集配体的系统进化"(SELEX)技术筛选出来的。这种Cell-SELEX技术筛选的靶标有癌细胞，正常细胞和炎症细胞等，器官和组织也有很多，有脑、肺、肝、胰腺、乳腺和卵巢等。其中SELEX主要包括毛细管电泳-SELEX (CE-SELEX)、细胞SELEX、快速SELEX。Cell-SELEX的主要优势在于，与以前的SELEX技术相比，Cell-SELEX的选择过程可以在不需要靶蛋白基础上进行。但是Cell-SELEX也有一些缺点，比如它需要更多的筛选时间，对目标细胞的任何损伤都会影响筛选结果。适配体的优点：(1)它具有非常广泛的靶标范围；(2)适配体制备时间较短，它是在体外制备，从而避免了长时间免疫；(3)适配体易于修饰，有较高的稳定性；(4)适配体的批与批之间的变化较少；(5)适配体的制备成本比单克隆抗体低；(6)高组织渗透率(由于它们的小尺寸)，脱水形式的稳定性高，易于化学合成；(7)适配体可长期保存；(8)适配体对温度不敏感，可耐受80℃，而单克隆抗体则变性；(9)适配体分子量较小，治疗时很容易穿透肿瘤等组织。此外，适配体还具有靶点广泛、有高特异性、高亲和力、低免疫原性、纳米尺寸(直径约1 ～ 2nm)等诸多优点。

1 核酸适配体用于肺腺癌早期诊断和治疗的现状

肺癌仍然是我国死亡率的榜首，它严重的危害了人类的健康。肺癌有两种组织学类型：非小细胞肺癌(NSCLC)和小细胞肺癌(SCLC)，非小细胞肺癌占肺癌病例的80%以上。疾病的分期影响非小细胞肺癌患者的预后，5年生存率低[4]。其中非小细胞肺癌可以分为三个亚型：腺癌、鳞癌和大细胞肺癌。尽管肺癌的筛查、诊断和治疗取得了很大的进展，但是有约70%的患者在目前的医疗环境下很难被诊断出来，导致肺癌预后不良。因此，早期诊断与治疗是提高肺癌患者生存率的关键。然而，目前大多数的肺癌诊断方法，如X射线、螺旋CT、MRI、PET/CT、纤维支气管镜检查、纵隔镜检查，光学相干断层扫描、正电子发射断层扫描[5]，都是基于形态学标准的，但是这些标准对早期发现不敏感，对癌症也不特异。因此，非小细胞肺癌的早期诊断和治疗越来越依赖于分子探针的开发，这些探针可以识别肺癌发生发展中的异常，并使临床医生能够识别不同的亚型。寻找更多临床上有效的肺癌生物标志物以及肺癌诊断仍是一项具有挑战性的工作。适配子作为一类用于疾病诊断和治疗的新型分子探针引起了人们的极大关注。目前为止，已经用这种方法筛选出了针对白血病细胞、肝细胞和小细胞肺癌细胞的适配子。最常见的肿瘤标记物主要包括神经元特异性烯醇化酶(NSE)[6]、前列腺特异抗原(PSA)、甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、细胞角蛋白19片段(CYFRA21-1)、CA25、CA53、CA199,然而传统的肺癌诊断技术灵敏度特别低，不能发现早期肺癌患者，因此核酸适配子代替抗体用于临床检测和治疗已经成为大势所趋。

研究发现，一种新型的Gal-1靶向DNA适配子(AP-74M-545)，通过恢复免疫功能来证明该适配子的抗肿瘤作用，AP-74M-545与Gal-1高亲和力结合。数据表明，Gal-1适配子通过阻断Gal-1和CD45之间的相互作用而抑制肿瘤生长，从而从凋亡中拯救T细胞，恢复T细胞介导的免疫。这些结果表明AP-74M-545可能是一种潜在的肿瘤免疫治疗策略。Kun Li等人首次以肺癌患者血清为靶点，在肺癌患者血清中筛选出6种与肿瘤标志物具有特异性亲和力的DNA适配子，为肺癌的早期诊断提供了一种新的高效、准确的方法。研究通过消减SELEX技术筛选与肺癌患者血清有较强亲和力的特异性核酸适配子，将羧化琼脂小球在不同筛选参数下与肺癌患者血清蛋白结合，最终获得6种特异性核酸适配子。为了去除靶分子，例如非靶物种的核酸适配子，首先进行阴性筛选。随后，将回收的上清液和磁珠与肺癌患者血清一起孵育进行阳性筛选，然后在95℃下处理，获得肺癌患者血清的特异性ssDNA文库。获得的ssDNA文库通过实时定量PCR技术扩增，然后结合链霉亲和素-亲和素小球制备二级ssDNA文库，为下一步适配子的筛选做准备。最后，通过第二代基因高通量测序分析来确定富集的适体序列和特异结合靶分子的适体序列的富集含量。结果显示所获得的6个适配子对肺癌患者血清具有特异性亲和力，而对健康人血清没有特异性亲和力，表明所获得的适配子对肺癌患者血清具有较高的特异性亲和力。

2 核酸适配体偶联药物在肺腺癌治疗中的应用现状

表皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶抑制剂(TKI)厄洛替尼在肺癌治疗中具有良好的疗效。不幸的是，携带TKI耐药EGFR突变的个体通常会对厄洛替尼产生获得性耐药性。为了克服这种耐药性，有研究者开发了以抗表皮生长因子适体(APT)结合壳聚糖(APT-Cs)为稳定载体的脂质体，脂质体因其固有的生物相容性和生物降解性而被认为是一种很有前途的药物载体，具有亲水核和疏水壳的双层纳米材料，可以包裹水溶性较差的厄洛替尼[7]。将厄洛替尼输送到靶部位，将厄洛替尼负载到apt-Cs锚定的脂质体复合物(apt-CL-E)中，并表征了apt-CL-E的理化性质，该纳米粒表现出良好的生物稳定性和对APT引导的EGFR突变的癌细胞的结合特异性。这种特异性结合促进了apt-CL-E在EGFR突变的癌细胞中的摄取。细胞毒性研究表明，APT-CL-E在将厄洛替尼输送到EGFR突变的癌细胞中，导致细胞周期阻滞和凋亡方面比其非靶向脂质体具有优势。

肿瘤疾病化疗也会发生耐药性，所以通过内吞作用选择性靶向给药，可以减少药物剂量和不良反应，同时也能最大限度地提高治疗效果。德国学者开发了一种疏水性化疗药物(如紫杉醇，PTX)的靶向给药平台，其基础是聚乙二醇(PEG)与聚己内酯(PCL)形成PEG-PCL胶束，并以APTS为靶向基团。这些APT-NPs选择性地将PTX靶向NSCLC A549细胞模型，并有效地清除了它们，同时避免了对正常人其他器官的的毒性作用。结论研制了一种生物相容性嵌段共聚物PEG-PCL胶束包埋疏水性化疗药物PTX的给药系统。研究了核酸适体修饰的纳米粒子在药物稳定和肿瘤靶向方面的双重作用，确定了纳米粒子上最佳的适配体的浓度，负载PTX的APT(30)-NPs的尺寸约为15 nm(即在用于癌细胞靶向的理想尺寸范围内：10-50 nm)。这一显著的治疗窗口可以促进最小剂量药物的给药，同时提高化疗药物治疗的疗效，减少副作用，并降低治疗成本。

3 核酸适配体在肺腺癌应用中面临的问题及解决方法

由于我们目前对于疾病的诊断仍然不够准确，核酸适配体，它作为一种新型的分子探针[8]，将提供了一种全新的方法，从而对疾病进行诊断和靶向治疗。"适配子"它们是在体外从随机序列池中挑选出来的。与以前的血清学肿瘤标志物检查相比，肿瘤标志物筛选出的核酸适配体具有很高的特异性，加上影像学检查结果，能够使肺腺癌早期诊断更加准确。核酸适配体有很多优势，还能进行适配体-药物偶联，作用于某个靶点，起到靶向治疗的作用，从而降低化学药物的毒性作用。同时一些适配体还可以被开发成生物传感器。但是核酸适配体是一把双刃剑，它还存在着一些问题：(1)它的稳定性较差，从体外筛选得到的适配体在体内容易被核酸酶降解[9]；(2)适配体，体积小(约20kDa)，它可以迅速地从循环中清除，因此表现出较差的药动学和治疗潜力。对于这些缺点，可以从以下几个方面来解决上述问题(1)通过一些化学修饰，可以提高核酸适配体的核酸酶抗性；(2)筛选具有稳定结构的适配体，如G-四聚体可以提高核酸适配体的稳定性；(3) 解决核酸适配体易被肾脏过滤清除的问题，与大分子生物偶联，比如偶联一些纳米材料。上述方法均可提高核酸适配体在体内应用的有效性，随着研究的深入，核酸适配体现如今应用于肺腺癌早期诊断和靶向治疗，给肿瘤的诊断和治疗注入了新的生机。；虽然不同癌细胞系的许多适配子都在开发，但是当前广泛应用的适配体的种类仍然非常有限，远远不能满足人们的实际需求，因此研发更多的核酸适配体用于癌症的诊断与治疗，将会使更多患者得到更好的治疗。