ICSI联合氯化锶辅助激活人卵母细胞成功妊娠1例及文献复习

檀畅，王喜良，张金艳，魏威，崔鑫，邹朋书，于月新

（北部战区总医院生殖医学中心，沈阳 110016）

随着辅助生殖技术的快速发展，体外受精（IVF）技术为不孕不育夫妇提供了拥有自己后代的可能性，但IVF对于精子不能结合卵母细胞或精子不能穿透透明带的情况却无能为力，为解决此类难题，卵胞浆内单精子注射（ICSI）技术应运而生。此技术为许多男性少弱精子症及无精子症患者的生育提供了可能，但大量统计资料表明，采用ICSI的受精率也仅在70%左右，仍有30%的卵母细胞不受精，卵母细胞活化不足是ICSI受精失败的重要因素之一［1］。其原因可能是虽然ICSI操作将精子直接注入卵母细胞，但其不能激活卵母细胞，无法完成后续的第二极体排出、DNA去紧密化、原核形成等过程，导致受精失败。因此，ICSI应用于辅助生殖领域，虽然取得了不错的临床效果，但仍然不能完全避免受精失败的发生，有研究认为ICSI操作中完全受精失败的发生率约为2%～3%［2］。我中心也有类似ICSI后受精失败的病例出现。分析其原因，发现ICSI操作受精失败的卵母细胞中有80%以上处于MⅡ期阻滞状态。随着技术的不断发展，有研究报道可以通过物理或化学的人工辅助激活方法使卵母细胞胞浆内产生钙脉冲信号，诱导卵母细胞完成减数分裂从而改善ICSI受精失败的结局，并获得正常发育的胚胎［3］。国外已有利用人工辅助卵母细胞激活技术进行助孕治疗并最终获得健康且发育正常婴儿的报道［4］。2015年，Karaca等［5］应用钙离子载体成功激活卵母细胞并最终获得健康胎儿。Eindhoven等［6］通过比较正常分娩婴儿和通过辅助卵母细胞激活技术出生的婴儿发现，二者的发育并未出现显著差异。本研究回顾性分析我院收治的一对不育夫妇采用氯化锶（SrCl2）辅助激活卵母细胞并行ICSI助孕成功妊娠的临床资料，以期为临床上卵母细胞激活的应用方案积累资料。

一、资料与方法

1．病例资料：不育夫妇中女方26岁，男方28岁，婚后未避孕但6年一直未孕。2016年因男方重度少弱精子症，在外院行ICSI助孕，采用拮抗剂方案，予普利康150U启动，Gn 11d，经阴道穿刺取卵（OPU）获卵21枚，均未受精。染色体结果提示：46，XX，21ps＋。2017年来我中心就诊，男方在我院精液常规检查结果及服药后复查结果均提示：严重少弱精子症。

2．治疗方案：夫妻双方签署知情同意书后行人工辅助激活卵母细胞ICSI助孕，并获本院伦理委员会批准。采用本生殖中心常规的IVF－ET促排卵长方案［7］进行控制性促排卵，卵泡径线达18mm时注射 HCG（艾泽，默克－雪兰诺，德国）10 000U，36h后在阴道B超引导下穿刺取卵。女方于2018年8月30日取卵，获卵19枚，其中15枚成熟卵。由于男方患有重度少弱精子症，因此采用密度梯度离心法处理精液，将液化后的精液加入37℃恒温的3ml梯度离心培养液中，600 g离心20min；吸出沉淀，加入3ml精子冲洗培养液后300 g离心5min待用。镜下计数离心前后精子的浓度、活力。取卵后4h行ICSI。

ICSI操作前，取1mg SrCl2（Sigma，美国）置入1 338．56μl二甲基亚砜（DMSO）中溶解，分装成每支10μl，－20℃冷冻储存，此为100×浓缩液。用时取出1支，加至1ml培养液，终浓度为10mmol／L。ICSI后1h，将受精卵放入上述激活液内，培养箱（保温、保湿、气体平衡）中作用30min，培养液滴内洗涤5次以上，转移至Quinns－1026卵裂液常规培养。

激活后16～18h进行原核评估，见到2个清晰独立的原核为正常受精卵。其中4枚胚胎出现双原核（即正常受精），培养至第3天（D3）得到4枚卵裂期胚胎，考虑到存在卵巢过度刺激综合征（OHSS）风险，放弃鲜胚移植，挑选2枚发育良好的卵裂胚进行玻璃化冷冻；剩余2枚胚胎继续培养至D7，仅形成1枚囊胚进行冷冻，另1枚胚胎退化。

二、结果

2019年1月3日复苏该患者的2枚D3胚胎，复苏存活率为100%。采用人工周期方案准备内膜，月经期开始使用补佳乐（戊酸雌二醇1mg／片，拜耳医药，德国）4mg，1周后B超监测内膜厚度，达到8mm左右时给予黄体酮注射液（浙江仙琚制药）60mg／d肌肉注射转化内膜。之后将两枚复苏胚胎移植回体内。移植后14d妊娠试验阳性，之后保持随访，B超检查显示单胎存活，常规产检至8月27日顺产分娩一男婴，体重2 700g，孕周36＋3周，各项指标正常。

三、讨论

精子和卵母细胞受精过程中启动减数分裂恢复的关键因素是Ca2＋振荡。在哺乳动物中，外源性的生理刺激可诱导其发生。卵母细胞激活的过程可通过人工诱导来实现，较常用的方法包括：电刺激的物理方法；在常规ICSI中将精子注入卵母细胞质膜时反复多次抽吸胞浆的机械刺激法；将卵母细胞暴露于Ca2＋载体 A23187、乙醇、伊屋诺霉素、SrCl2、巴豆醇、硫柳汞、蛋白质合成抑制剂或蛋白磷酸化抑制剂中等化学激活方法［8－12］。

现阶段，人工卵母细胞辅助激活是治疗既往ICSI受精低下或失败的有效措施之一［13］。应用相对广泛的主要有 Ca2＋载体［14］、6－二甲基氨基嘌呤（6－DMAP）［15］和等化学方法，其中SrCl2通过促进胞质内存储的Ca2＋释放来增加细胞内游离Ca2＋的浓度。Sr2＋与Ca2＋是同族的阳离子，其可经细胞膜上的Ca2＋通道进入细胞内，再通过磷酸肌醇途径进入钙池，置换出内质网和线粒体中的Ca2＋，使胞质内游离的Ca2＋增加。进入细胞内的Sr2＋不仅引起内源性Ca2＋的释放并且不被消耗进而引起Ca2＋震荡，不仅与正常受精非常相似，而且具有频率低、幅度小、持续时间长等特点，能有效激活卵母细胞［17］。SrCl2在动物中的应用较为广泛，目前其在人卵母细胞辅助激活中的应用在国内鲜有报道。国外有研究报道了5例Sr2＋辅助卵母细胞激活后分娩的婴儿，观察婴儿出生后12个月内身体和智力的发育情况，结果未发现异常［18］。亦有文献报道，6例患者使用10mmol／L SrCl2辅助激活卵母细胞后行鲜胚移植、冻融胚胎移植，最终4例患者成功妊娠，分娩健康婴儿［19］。国外有学者跟踪随访8名ICSI联合SrCl2辅助激活分娩的婴儿至60个月，发现8名婴儿均发育正常、身心健康，与正常分娩的儿童无明显差异［20］。上述研究在一定程度上证实了Sr2＋辅助激活卵母细胞方法的安全性。

不可否认，卵母细胞激活亟须深入研究，若能明确人工辅助激活卵母细胞安全有效的方法，不仅能解决大部分ICSI受精失败的难题，并且对IVF受精失败的卵母细胞也可以采用补救ICSI联合人工辅助激活的处理方式，最大限度地挽救未受精卵母细胞，提高卵母细胞受精率，并在一定程度上改善胚胎的发育潜能，使更多患者获得临床妊娠及活产。本病例也是我中心胚胎实验室首次应用SrCl2成功激活卵母细胞并联合使用ICSI使患者获得临床妊娠。虽然众多研究证据显示SrCl2能有效激活卵母细胞，结合ICSI技术可以成功妊娠并获得健康的新生儿，改善既往ICSI受精失败或受精率低下患者的临床结局。但是该方法中依然存在一些问题不容忽视，比如人工辅助激活的稳定性，整个激活过程中任何细节的改变，都可能使胚胎面临风险；SrCl2等不同的化学激活剂在激活过程中的最佳作用时间、激活方式等都需要大样本的研究证实；目前所报道出生儿例数较少，其对子代的潜在影响尚难以确定。因此，对于既往ICSI受精失败的患者，应持谨慎态度，在向患者夫妇介绍这种技术的同时也要向其详细解释该技术的风险以及对后代健康可能产生的影响，尊重患者的选择。且本研究未设置对照组验证卵母细胞激活的效果，后期需要增加数据收集并完善研究设计，进行深入的研究和探讨，以早日明确其安全性，更好地应用于临床。