舒正颗粒对2型糖尿病大鼠糖脂代谢异常PI3K/AKT信号通路的影响

陆梓华， 吕雄， 曹明满， 毕建璐， 黄艳丽

（1.广州中医药大学，广东广州 510405；2.广东省第二中医院，广东广州 510095；3.广州医科大学附属第二医院番禺院区，广东广州 511400；4.珠海市第二中医院，广东珠海 519125）

2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）是以胰岛素抵抗（insulin resistance，IR）为基础的一种代谢性疾病，除有血糖的异常外，常伴有脂质代谢的紊乱。研究[1]证实，糖尿病显著和持续的高血糖所造成的糖毒性以及脂毒性是引起或加重IR和胰岛素分泌下降、胰岛β细胞功能衰竭的原因。胰岛素作用最重要的靶器官是肝脏，其主要通过促进糖原合成、增加葡萄糖摄取、减少葡萄糖输出和糖异生等作用来调控血糖并维持血糖稳定。胰岛素通过与胰岛素受体相结合，可激活其下游的磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）信号通路，再作用于肝脏等靶器官而发挥调节血糖的作用。PI3K/AKT信号通路异常，是2型糖尿病发生的基本机制[2]。舒正颗粒是第五批全国名老中医药学术经验继承工作导师吕雄教授创立的调节糖脂代谢紊乱的有效经验方，前期临床观察表明舒正颗粒能有效调节糖尿病糖脂代谢异常状态，改善微循环的灌注障碍[3-5]，但其机制有待进一步阐明。因此，本研究拟探讨舒正颗粒对2型糖尿病大鼠肝脏PI3K/AKT信号通路的作用，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 动物 SPF级SD雌性大鼠70只7～8周龄，体质量200～220 g，为广东医学实验动物中心提供，动物生产许可证号：SCXK（粤）2013-0002。于广东省第二中医院中药药理（毒理）实验室分笼喂养，室温18～25℃，相对湿度40%～70%，明暗交替12 h，自由饮水、采食。

1.2 药物 舒正颗粒，由生晒参、白术、茯苓、桃仁、布渣叶、麦冬等11味中药组成，广东省第二中医院制剂室生产，批号：粤20071356；盐酸二甲双胍片，由中美上海施贵宝制药有限公司生产，批准文号：国药准字H20023370，规格：0.5 g/片。

1.3 主要试剂与仪器 空腹血糖（FPG）、空腹胰岛素（FINS）、总胆固醇（TC）、甘油三脂（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）试剂盒（中生北控生物科技有限公司）；HbA1c试剂盒（南京建成生物工程研究所）；链脲佐菌素（STZ，美国Sigma公司）；10%水合氯醛（成都市科龙化工试剂厂）；β-actin抗体、胰岛素受体底物2（IRS2）抗体、PI3K抗体、AKT2抗体（英国Abcam公司）；叉头框蛋白O1（FoxO1）抗体（美国Cell Signaling Technology公司）；PierceTMBCA蛋白分析试剂盒（500 mL）、ECL发光检测试剂盒、RNA反转录试剂盒、定量DNA PCR试剂盒（美国Thermo公司）。IQTM5型荧光定量PCR仪（美国Bio-Rad公司）；Tanon 5200 Multi多功能成像系统（上海天能科技有限公司）；PowerPac Basic电泳仪（美国Bio-Rad公司）；JJ3000动物电子称（美国G&G公司）；Bio-Rad680酶标仪（美国Bio-Rad公司）；Milli QPlus超级纯水仪（美国Millipore公司）。

1.4 分组与造模方法 大鼠适应性喂养1周后，随机分为正常组（10只）与造模组（60只）。正常组以普通饲料喂养。造模组大鼠以高脂饲料（按质量分数配比：猪油20%、蔗糖5%、果糖5%、胆固醇5%、thyreostat 1%、盐6%、味精1%、丙二醇30%、吐温80 20%）喂养2周后，空腹单次腹腔注射STZ（30 mg/kg），检测大鼠尾静脉血，以随机血糖≥16.7 mmol/L判断2型糖尿病模型复制成功。再继续高脂喂养6周[6-7]以维持、强化胰岛素抵抗状态，并使血脂进一步紊乱。造模共8周，其中10只大鼠造模失败。将造模成功的50只大鼠随机分为5组，即模型组，二甲双胍组，舒正颗粒高、中、低剂量组，每组10只。

1.5 给药 造模结束后，舒正颗粒高、中、低剂量组给予舒正颗粒灌胃（剂量分别为5.40、2.70、1.35 g·kg-1·d-1）。二甲双胍组给予二甲双胍（剂量为1.80 g·kg-1·d-1）灌胃。正常组与模型组给予等容积蒸馏水，并始终以脂肪乳灌胃。药物干预4周。给药剂量参考人和动物间按体表面积折算的等效剂量比率表[8]和《实验动物学》[9]制定。

1.6 检测指标及方法[10]

1.6.1 生化指标 FPG检测采用葡萄糖氧化酶法；FINS、HbA1c检测采用酶联免疫吸附分析（ELISA）；TC含量检测采用胆固醇氧化酶—过氧化物酶偶联（COD-PAP）法；TG含量检测采用甘油磷酸氧化酶—过氧化物酶（GPO-PAP）法；HDL-C检测采用过氧化氢酶清除法；LDL-C检测采用表面活性剂清除法。

1.6.2 蛋白免疫印迹（Western Blot）检测肝脏组织IRS2、PI3K、AKT2、FoxO1蛋白含量 操作步骤：称取每只大鼠肝脏组织10 mg，每组共100 mg作为一个样品，每个样品每个目的蛋白重复试验4次。往各蛋白样品加入1 mL含PMSF的RIPA裂解液，充分裂解后提取总蛋白，并按照BCA试剂盒说明书步骤测定蛋白浓度，根据所测定的蛋白浓度决定上样量。依次按配胶、电泳、转膜、封闭的顺序，使提取的蛋白与目的蛋白抗体结合并免疫杂交，最后将杂交产物条带放入Tanon 5200 Multi成像系统中进行显影成像。计算目标蛋白的相对表达量：分析目的蛋白条带灰度值，并以β-actin条带灰度值为参考，计算目标蛋白灰度值/内参灰度值（p）。

1.6.3 实时定量逆转录聚合酶链反应（RT-qPCR）法检测肝脏组织IRS2、PI3K、AKT2、FoxO1 mRNA相对表达量 操作步骤：（1）称取每只大鼠肝脏组织100 mg，加入1 mLTrizol裂解液，冰上充分研磨匀浆，经氯仿、体积分数75%乙醇清除杂质后提取总RNA，测定吸光度（D）（260 nm）/D（280 nm）比值，计算RNA的浓度和纯度。（2）逆转录成cDNA。按照总RNA 1μg，Olig（odT）15 1μL，随机引物1μL，ddH2O加至12μL。继而5×逆转录Buffer 4μL，M-MuLV Reverse Transcriptase 1μL，10 mMdNTPMix 2μL，ddH2O 1μL配制总体积为20μL的反应体系进行逆转录。（3）PCR扩增。基因的引物由美国invitrogen公司设计提供（见表1）。按照 Template（cDNA）1 μL、MaximaTMSYBR Green/Fluorescein qPCR Master Mix（2×）12.5 μL、Former primer 1μL，Rear primer 1μL，dd H2O 9.5μL，总体积为25μL的扩增体系进行PCR扩增，循环条件：94℃×5 min；94℃×30 s→55℃×30 s→72℃ × 50 s（45个循环）；72℃ × 7 min。（4）采用2-△△Ct法计算各目的基因的相对表达量，计算公式为：F=2-（[待测组目的基因平均Ct值-待测组内参基因平均Ct值）-（对照组目的基因平均Ct值-对照组内参基因平均Ct值）]。

表1 PCR基因引物信息Table 1 Data of PCR gene premier

1.7 统计方法 应用SPSS22.0统计软件进行数据分析，所有数据以均数±标准差(-x±s)表示。符合正态分布资料，组间比较采用方差分析，总体均值统计先进行Levene's方差齐性检验，方差齐时采用SNK法，方差不齐则采用Dunnett T3检验法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 舒正颗粒对糖尿病大鼠FPG、HbA1c、FINS水平的影响 见表2。与正常组比较，模型组大鼠FPG、HbA1c、FINS水平均显著升高（P ＜0.05）；与模型组比较，舒正颗粒各剂量组及二甲双胍组大鼠FPG、HbA1c、FINS水平均显著降低（P＜0.05）；与二甲双胍组比较，舒正颗粒高剂量组大鼠FPG、HbA1c、FINS水平差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.2 舒正颗粒对糖尿病大鼠血脂水平的影响 见表3。与正常组比较，模型组大鼠TC、TG、LDL-C水平均显著升高（P＜0.01），HDL-C水平显著降低（P＜0.01）；与模型组比较，舒正颗粒各剂量组及二甲双胍组大鼠TC、TG、LDL-C水平显著降低（P＜0.01），HDL-C水平显著升高（P＜0.01），且舒正颗粒中、高剂量组调节血脂的作用优于二甲双胍组（P＜0.01）。

表2 舒正颗粒对T2DM大鼠FPG、HbA1c、FINS水平的影响Table 2 The effects of Shuzheng Granules on the levels of FPG，HbA1c，FINS in T2DM rats (-x±s)

表3 舒正颗粒对T2DM大鼠TC、TG、LDL-C、HDL-C水平的影响Table 3 The effects of Shuzheng Granules on the levels of TC，TG，LDL-C，HDL-C in T2DM rats[-x±s，c/（mmol·L-1）]

2.3 舒正颗粒对T2DM大鼠肝脏组织IRS2、PI3K、AKT2、FoxO1 mRNA相对表达量的影响 见表4。与正常组比较，模型组肝脏组织IRS2、PI3K、AKT2 mRNA表达均显著降低（P＜0.05或P＜0.01），FoxO1 mRNA表达显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，舒正颗粒高剂量组及二甲双胍组的IRS2、PI3K、AKT2 mRNA表达均显著升高（P＜0.05或P＜0.01），FoxO1 mRNA表达显著降低（P＜0.01），舒正颗粒中、低剂量组AKT2 mRNA表达升高，FoxO1 mRNA表达降低（P ＜0.01），IRS2、PI3K mRNA表达亦升高，但差异无统计学意义（P＞0.05）；与二甲双胍组比较，除舒正颗粒中、低剂量组IRS2、PI3K mRNA表达差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）外，舒正颗粒高、中、低剂量组的IRS2、PI3K、AKT2、FoxO1 mRNA表达差异均无统计学意义（P＞0.05）。

2.4 舒正颗粒对T2DM大鼠肝脏组织IRS2、PI3K、AKT2、FoxO1蛋白含量的影响 见表5、图1。与正常组比较，模型组大鼠肝脏组织IRS2、PI3K、AKT2蛋白含量均显著降低（P＜0.05或P＜0.01），FoxO1蛋白含量显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，舒正颗粒高剂量组及二甲双胍组的IRS2、PI3K、AKT2蛋白含量均显著升高（P＜0.05），FoxO1蛋白含量显著降低（P＜0.05），舒正颗粒中剂量组IRS2、AKT2蛋白含量升高（P＜0.05），PI3K、FoxO1蛋白含量降低，但差异不显著（P＞0.05），舒正颗粒低剂量组AKT2蛋白含量升高（P＜0.05），IRS2、PI3K、FoxO1蛋白含量降低，但差异不显著（P＞0.05）；与二甲双胍组比较，舒正颗粒高剂量组IRS2、PI3K、AKT2、FoxO1蛋白含量表达无统计学差异（P＞0.05），舒正颗粒中剂量组IRS2蛋白含量表达无统计学差异（P＞0.05），PI3K、AKT2蛋白含量表达降低（P＜0.05），FoxO1蛋白含量表达升高（P＜0.01），舒正颗粒低剂量组IRS2、PI3K、AKT2蛋白含量表达均显著降低（P＜0.05），FoxO1蛋白含量升高（P ＜ 0.01）。

表4 舒正颗粒对T2DM大鼠IRS2、PI3K、AKT2、FoxO1 mRNA表达的影响Table 4 The effects of Shuzheng Granules on the mRNA expression levels of IRS2，PI3K，AKT2，FoxO1 in T2DM rats （-x±s，p）

表5 舒正颗粒对T2DM大鼠IRS2、PI3K、AKT2、FoxO1蛋白含量的影响Table 5 The effects of Shuzheng Granules on the protein contents of IRS2，PI3K，AKT2，FoxO1 in T2DM rats (-x±s)

图1 β-actin、IRS2、PI3K、AKT2、FoxO1蛋白Western blot条带图Figure 1 Western blot strips ofβ-actin，IRS2，PI3K，AKT2，FoxO1 proteins

3 讨论

T2DM属中医“消渴病”范畴。吕雄教授[11]结合中医理论及其临床经验，认识到对消渴病的认识不应局限于阴虚燥热、三消辨证，而独创气血肝脾理论，提出脾损致消、肝郁致消、浊毒瘀滞等观点，认为消渴病为本虚标实之证，以脾气亏虚为本，浊毒瘀滞为标，治疗应以扶正祛邪为则，益气化浊、祛瘀通络为大法。舒正颗粒由生晒参、茯苓、白术、泽泻、川芎、桃仁、丹参、麦冬、布渣叶、薤白、决明子等药物组成。方中君药生晒参益气健脾，扶正祛邪，治病以求本，臣以白术、茯苓、泽泻燥湿健脾，健脾宁心，与君药合用，实为取四君子汤之益气补虚之意；丹参、川芎、桃仁行气活血，化瘀通络，布渣叶、决明子化浊消滞，清热利湿，再加薤白通阳散结，麦冬养阴清热，以制约生晒参、川芎、薤白之燥热。诸药用之，共奏益气化浊、祛瘀通络之功。

PI3K/AKT信号通路是胰岛素的主要下游分子通路，与细胞生长、分化、增殖、凋亡及葡萄糖转运密切相关，该通路异常是胰岛素抵抗和2型糖尿病发生的基本机制[2]。IRS2是维持胰岛β细胞功能的重要信号蛋白，胰岛素与胰岛素受体结合后，会导致其自身的磷酸化并使IRS2酪氨酸位点磷酸化。磷酸化的IRS2酪氨酸残基与PI3K的调节亚基p85结合，进而激活下游的PI3K。活化的PI3K将磷脂酰肌醇一磷酸转化为磷脂酰肌醇二磷酸和磷脂酰肌醇三磷酸，并作为其第二信使激活AKT。活化的AKT同时可以使FoxO1磷酸化并继而失活，降低糖异生基因G6P及PEPCK水平，从而减少糖异生，最终使血糖降低[12-13]。

本研究结果显示，舒正颗粒能显著降低2型糖尿病大鼠FPG、HbA1c、FINS、TC、TG、LDL-C，并使HDL-C明显上升，说明舒正颗粒可以改善糖尿病糖脂代谢异常状态。与模型组比较，二甲双胍组、舒正颗粒高剂量组IRS2的蛋白含量及mRNA的表达均升高，说明二甲双胍和舒正颗粒均能上调糖尿病大鼠IRS2的表达，从而发挥改善胰岛素分泌及胰岛素抵抗的作用，与黄琦等[14]得出的二甲双胍能上调糖尿病大鼠肝脏IRS2结果相符。与二甲双胍组比较，舒正颗粒高剂量组上调糖尿病大鼠IRS2表达无差异，考虑舒正颗粒对IRS2的影响与二甲双胍效果相似；且舒正颗粒中、低剂量组IRS2表达与二甲双胍组有差异，考虑舒正颗粒对IRS2影响呈一定的剂量依赖性。与模型组比较，二甲双胍组、舒正颗粒高剂量组PI3K表达均升高，说明二甲双胍和舒正颗粒均能上调糖尿病大鼠PI3K的表达，与程静等[15]提出的二甲双胍能够增加肝脏组织PI3K表达的结论相符，且二甲双胍组与舒正颗粒高剂量组调节PI3K表达效果无统计学差异，考虑舒正颗粒对PI3K的作用与二甲双胍效果相似。与模型组比较，二甲双胍组，舒正颗粒高、中、低剂量组AKT2表达均升高，说明二甲双胍和舒正颗粒均能上调糖尿病大鼠AKT2的表达，与李建中[16]研究显示的二甲双胍能上调大鼠AKT2蛋白含量的结果相符，且舒正颗粒高剂量组与二甲双胍组结果无统计学差异，考虑舒正颗粒对糖尿病大鼠肝脏AKT2的作用与二甲双胍相似；舒正颗粒中、低剂量组与二甲双胍组比较具有统计学差异，说明舒正颗粒作用于大鼠肝脏AKT2需要达到一定剂量浓度效果才更佳。与模型组比较，二甲双胍组，舒正颗粒高、中、低剂量组大鼠肝脏FoxO1 mRNA表达显著降低，二甲双胍组、舒正颗粒高剂量组FoxO1蛋白表达降低，说明二甲双胍和舒正颗粒均能下调糖尿病大鼠FoxO1的表达，与刘桐言[17]提出的二甲双胍能抑制FoxO1表达的结论相符；且舒正颗粒高剂量组与二甲双胍组无统计学差异，考虑舒正颗粒对FoxO1的抑制作用与二甲双胍相似。

综上所述，舒正颗粒能提高2型糖尿病大鼠肝脏PI3K/AKT信号通路相关蛋白的活性，有效改善糖尿病大鼠糖脂代谢异常状态，其效果呈一定的剂量依赖性。