菟丝子—黄芪治疗骨质疏松症的网络药理学机制研究

黄红， 林燕平， 黄佳纯， 黄宏兴

（1.广州中医药大学护理学院，广东广州 510006；2.广州中医药大学，广东广州 510405；3.广州中医药大学第三附属医院，广东广州 510375）

骨质疏松症（osteoporosis，OP）是一种与年龄相关的常见病，其特征是骨量降低、骨组织显微结构破坏，易致骨脆性增加及骨折风险增加[1]。预计到2050年，全世界60岁及以上的老年人口数将会从2000年的6亿增加到20亿[2]。随着世界人口老龄化的加速，OP已成为人类社会的“公敌”。OP及其相关疾病（诸如骨质疏松性骨折、肌少症、糖尿病、高血压等）不仅严重影响老年人群的生存质量，而且也给社会带来沉重的经济和医疗负担。目前，现代医学治疗OP主要应用骨健康基本补充剂、骨吸收抑制剂及促进骨形成剂等[3]，但由于西药不良反应多、价格昂贵、患者年龄大、基础疾病多等因素，患者依从性差，没有长期用药，治疗作用有限。因此，从传统中药中寻找安全、有效、价廉、不良反应少的中药治疗OP成为当前研究的热点[4-6]。

菟丝子—黄芪常见于治疗OP的方剂中[7-9]，具有补肾健脾益气的作用。多项研究表明，菟丝子黄酮可能通过抑制成骨细胞凋亡抗OP[10-12]，黄芪多糖、黄芪甲苷可能通过多种机制抗OP[13-16]。但中药所含成分复杂，作用靶点广泛，这些研究仅侧重于某一成分研究，不能全面评价中药多成分的作用机制。基于网络药理学的理论[17]，整合中药、中药活性成分、中药靶标及疾病靶标等信息，构建中药—成分—疾病—靶标调控网络，可为全面研究中药治疗OP的作用机制提供理论基础。本研究基于网络药理学的理论及方法，对菟丝子—黄芪治疗OP的作用机制进行探讨，以期为进一步的实验研究提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 菟丝子—黄芪的有效成分及靶标筛选 中药系统药理学分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Databaseand Analysis Platform，TCMSP）是一个提供药物、疾病和靶标之间关系的数据库[18]，该数据库为中药有效成分作用机制的研究提供了平台。首先检索TCMSP平台（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）获得菟丝子—黄芪的有效成分，其中检索条件[19]为口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥ 30%，药物类药性（drug likeness，DL）≥ 0.18。然后应用Perl软件（V5.26.3）和UniProt知识库（https：//www.uniprot.org/）为筛选出的靶标添加基因名。

1.2 OP相关靶标的获取 以“osteoporosis”为关键词，检索并筛选GeneCards数据库（https：//genealacart.genecards.org/）的疾病相关靶标，得到OP相关靶标。

1.3 中药—疾病靶标的构建 利用R语言软件（V3.5.3）将OP相关靶标映射到菟丝子—黄芪靶标，得到中药—疾病共同靶标的韦恩图，从中得到中药—疾病靶标。

1.4 中药—成分—疾病—靶标调控网络的构建 将“1.1”项获得的菟丝子—黄芪靶标和“1.3”项获得的中药—疾病靶标利用Perl软件进行一一映射，然后利用Cytoscape软件（V3.7.1）进行计算，得到中药—成分—疾病—靶标调控网络。其中节点的类型有中药、成分、疾病和中药—疾病靶标。

1.5 中药—疾病靶标蛋白相互作用网络（PPI）的构建与核心靶标的筛选 应用STRING在线软件（https：//string-db.org/）将中药—疾病靶标输入软件，筛选条件为种属选择“Homo sapiens”，最小互作分数值为0.4，保存相应结果文件。将所得文件输入R语言计算，得到PPI核心靶标的条图。

1.6 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析 将中药—疾病靶标利用R语言软件计算，得到基因本体论（GO）功能富集分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 菟丝子—黄芪有效成分的筛选和靶标预测结果 根据筛选条件：OB≥30%，DL≥0.18，检索TCMSP数据库中菟丝子—黄芪所有已报道的有效成分及其相关靶标，排除在UniProt知识库中找不到对应基因名的靶标，共获得有效成分21个，有效成分对应的靶标196个。见表1。

表1 通过TCMSP数据库对菟丝子—黄芪所有成分根据OB和DL参数进行筛选后的结果Table 1 The results of screening all ingredients of Herba Cuscutae-Radix Astragaliby OB and DL parameters in TCMSP database

2.2 中药—疾病靶标构建的结果 利用R语言软件将OP相关靶标与菟丝子、黄芪靶标取交集，得到中药—疾病共同靶标的韦恩图，从中得到中药—疾病靶标127个。其中OP疾病相关靶标3 126个，菟丝子靶标102个，黄芪靶标94个。见图1。

2.3 中药—成分—疾病—靶标调控网络构建的结果 图中红色代表OP，蓝色代表中药菟丝子—黄芪，绿色代表菟丝子—黄芪的有效成分，黄色代表中药—疾病共同靶标。中药菟丝子—黄芪含有的21种有效成分主要通过127个靶标来影响OP的发生。其中，作用最明显的2种成分是槲皮素（quercetin）和山柰酚（kaempferol）。见图2。

图1 中药—疾病靶标Figure 1 TCM-disease targets

图2 中药—成分—疾病—靶标调控网络Figure 2 The regulatory network of TCM-ingredientdisease-target

2.4 中药—疾病靶标PPI构建与核心靶标筛选的结果 据图4可知，中药—疾病核心基因按邻接节点数目由多到少依次为IL-6、VEGFA、CASP3、MAPK8、EGFR、MYC、ESR1、CCND1、AR、FOS、ERBB2、 PPARG、 RELA、 PGR、 CAV1、 AHR、HIF1A、CD44、ICAM1、VCAM1、CASP9、PLAU、RB1、CCNB1、CYP3A4、ESR2、IGFBP3、IGF2、NFKBIA、NQO1。邻接节点数目越多，成为核心基因的概率越大。见图3、4。

2.5 GO功能富集分析 菟丝子—黄芪治疗OP的核心靶标的GO功能富集分析结果见图5。菟丝子—黄芪治疗OP的核心基因的GO功能主要涉及转录激活活性、转录因子活性、辅因子结合活性、核受体活性、类固醇激素受体活性、RNA聚合酶Ⅱ转录因子结合、泛素样蛋白连接酶结合、类固醇结合等。

图3 中药—疾病靶标蛋白相互作用网络Figure 3 TCM-disease target protein protein interaction（PPI）network

图4 中药—疾病核心靶标的条图Figure 4 Barplot of TCM-disease core target

2.6 KEGG通路富集分析 菟丝子—黄芪治疗OP的核心靶标的KEGG通路富集分析结果见图6。菟丝子—黄芪治疗OP的核心基因的KEGG通路主要涉及：前列腺癌信号通路、糖尿病并发症的晚期糖基化终末产物—晚期糖基化终末产物受体（AGE-RAGE）信号通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化信号通路、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染信号通路、结直肠癌信号通路、乙肝信号通路、肿瘤坏死因子（TNF）信号通路、人巨细胞病毒感染信号通路、小细胞肺癌信号通路、EB病毒感染信号通路、内分泌失调信号通路、催乳素信号通路、细胞凋亡信号通路、麻疹信号通路、胰腺癌信号通路、乳腺癌信号通路等。

图5 GO功能富集分析气泡图Figure 5 Dotplot for GO functional enrichment analysis

综合有关OP信号通路的文献研究发现，前列腺癌信号通路[20-22]、糖尿病并发症的AGE-RAGE信号通路[23]、动脉粥样硬化信号通路[24-28]、结直肠癌信号通路[29-30]、乙肝信号通路[31-32]、TNF信号通路[33-35]、小细胞肺癌信号通路[36]、内分泌失调信号通路、细胞凋亡信号通路[37-39]、乳腺癌信号通路[40-41]等均参与OP的发病。

图6 KEGG通路富集分析柱状图Figure 6 Barplot for KEGG pathway enrichment analysis

3 讨论

本研究基于网络药理学的理论，通过构建“中药—成分—疾病—靶标”网络图，并对中药—疾病靶标进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，表明中药菟丝子—黄芪含有的21种有效成分主要通过127个靶标来影响OP的发生。中药菟丝子—黄芪治疗OP的核心靶标主要有IL-6、VEGFA、CASP3、MAPK8、EGFR、MYC、ESR1、CCND1、 AR、 FOS、 ERBB2、 PPARG、 RELA、PGR、 CAV1、 AHR、 HIF1A、 CD44、 ICAM1、VCAM1等，这些靶标可能通过影响转录激活活性、转录因子活性、辅因子结合活性、核受体活性、类固醇激素受体活性、RNA聚合酶Ⅱ转录因子结合、泛素样蛋白连接酶结合、类固醇结合等参与OP的发生。

中药菟丝子—黄芪治疗OP的核心靶标涉及的通路包括前列腺癌信号通路、糖尿病并发症的AGE-RAGE信号通路、动脉粥样硬化信号通路、结直肠癌信号通路、乙肝信号通路、TNF信号通路、小细胞肺癌信号通路、内分泌失调信号通路、细胞凋亡信号通路、乳腺癌信号通路等。刘流等[42]对前列腺癌患者行去势术，观察前列腺癌去势术与OP的关系，发现前列腺癌去势术后血清睾酮的急剧下降与OP的发病明显相关，表明前列腺癌与OP的发生有关。大量流行病学研究[25]表明，OP与动脉粥样硬化性疾病具有密切的联系，二者可能存在共同的发病机制，例如存在于脉管中的骨代谢标志物（骨钙素、骨形态发生蛋白、骨桥蛋白和骨保护素）可能引起动脉粥样硬化，而引起动脉粥样硬化的炎性因子（NF-κB和一氧化氮）具有调节骨代谢的作用。左辉[29]对结直肠癌合并幽门螺杆菌感染患者检测血中1型胶原氨基端前肽（PINP）、1型胶原羧基端肽β特殊序列（β-CTX）的水平，发现结直肠癌患者血中PINP和β-CTX低表达，OP发病风险增加。以上研究从不同的发病机制说明OP与多种疾病的发病相关，多种疾病可以通过多种信号通路影响OP的发病。

综上所述，本研究基于网络药理学方法全面系统分析了中药菟丝子—黄芪治疗OP的作用机制，中药菟丝子—黄芪通过调控OP相关的基因，OP相关的基因在机体内外环境的综合影响下表现出相应的表型，即发病或不发病。本研究为中药菟丝子—黄芪治疗OP的有效成分及靶标的筛选提供了理论依据，但仍需结合体内外实验进一步验证有效成分及靶标的作用机制，以期提高中药药效，促进中药现代化发展。