高效液相色谱-串联质谱法检测动物源性食品中异丙嗪

李志刚，李慧晨，马燕红*，王守伟，任 南，郭文萍，郭 超，李莹莹

（中国肉类食品综合研究中心，北京 100068）

盐酸异丙嗪属于噻吩嗪类抗组胺药，是一种对中枢神经系统有抑制作用的镇静剂，临床上用于治疗精神分裂症、狂躁症、抑郁症、反应性神经病及其他重症精神病[1]；也可用于镇吐、抗晕动以及镇静催眠[2]、支气管肺炎、腹泻、哮喘、食物过敏等症状的治疗[3]；在动物饲养和运输过程中使用以降低动物的维持需要和减少途中体质量降低、死亡率[4]。噻吩嗪类的镇静剂可造成过敏反应，引起体位性低血压、心悸、躁动、口干、药疹等副作用[5]，对人的内分泌、运动和循环等系统以及肝脏器官造成不良影响，引起肝功能障碍、接触性皮炎和皮疹等毒副作用[6-7]，给人体健康带来较大风险。因此日本、美国和欧盟等多个国家规定噻吩嗪类镇静剂及其代谢物不得在动物源食品中检出。我国农业部公告第176号、第2583号公告规定盐酸异丙嗪禁止在饲料和动物饮用水中使用。但一些不法商贩利用盐酸异丙嗪强大的镇静、催眠、镇吐作用，降低动物大量注水后发生过激反应，同时结合其他药物使用，减缓畜类的疼痛感、增加宰后产品质量，获取不义之财。

图1 异丙嗪的结构式Fig. 1 Chemical structure of promethazine

目前鲜见动物源性食品中异丙嗪（结构式如图1所示）检测的国家标准，已报道这类镇定剂化合物的检测方法主要有红外光谱法[8]、酶联免疫法[9]、气相色谱-质谱法[10-12]、高效液相色谱-紫外法[13-15]、毛细管电泳-电致化学发光法[16]、液相色谱-质谱法[17-23]等。但这些文献大部分的基质多为人或动物的血液、尿液、药品，并不适用于肉类的检测；齐士林等[17]虽建立了动物源性食品中氯丙嗪和异丙嗪的检测方法，但其方法定量限为5 μg/kg，不能满足目前兽药残留痕量检测的需要。因此迫切需要建立适用于畜肉及其内脏中异丙嗪的高灵敏度、低检出限的检测方法。

本实验室在之前的工作中发表了鲜冻肉中6 种保水药物的检测方法[24]，本实验旨在建立一种适用于动物肌肉、肾脏、肝脏等多种基质中异丙嗪检测的方法，弥补当前国家标准的缺失，为注水肉的检测提供有效手段。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

盐酸异丙嗪标准品（纯度＞99%） 德国Dr.Ehrensorfer公司；甲醇、乙腈、甲酸（均为色谱纯）国药集团化学试剂有限公司；水为一级水。

1.2 仪器与设备

1260高效液相色谱仪-6470串联四极杆质谱 美国Agilent公司；UPLC-Q Exactive HF-X超高效液相色谱-复合四极杆-轨道阱质谱仪 赛默飞世尔科技（中国）有限公司；S-100涡旋仪、SR-IIw振荡器 日本Taiyo公司；离心机 日本Hitachi公司；Milli-Q纯水仪 美国Millipore公司；HLB固相萃取柱 美国Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液配制

标准溶液：准确称取适量盐酸异丙嗪（折算成异丙嗪，折算系数为88.6%）标准品10.0 mg，用甲醇溶解后稀释至刻度，配制成质量浓度为100 mg/L的标准储备液，置-18 ℃冰箱冷冻贮存。

标准中间使用液的配制：吸取1.00 mL标准储备液于100 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，作为标准中间液，置-18 ℃冰箱贮存。

基质标准工作溶液：取一空白基质样品（需根据样品类型选取适合的空白基质），添加不同水平标准溶液，然后提取、净化样品，得到基质标准曲线。

1.3.2 提取

称取均质后试样5 g（精确至0.01 g）置于50 mL具塞塑料离心管中，加入10 mL酸化乙腈（0.1%甲酸），加盖后涡旋混匀2 min，振荡器振荡30 min，10 000 r/min离心10 min，上清液倒入另一离心管中。于残渣中再加入10 mL酸化乙腈（0.1%甲酸），同法操作重复上述步骤，合并两次上清液，用旋转蒸发器于40 ℃水浴减压蒸发，将提取液减压旋蒸至近干，加2.0 mL水复溶，待净化。

1.3.3 净化

HLB净化柱使用前依次用3 mL甲醇和3 mL水活化，保持柱体湿润。将待净化液加入固相萃取小柱，流速控制在1 mL/min内，用3 mL水淋洗小柱，弃去全部流出液，最后用5 mL甲醇洗脱，回集洗脱液。洗脱液在40 ℃氮吹至近干，加入甲醇1.00 mL涡旋混匀，0.22 μm滤膜针头滤器过滤后供高效液相色谱-串联质谱测定。实验均平行3 次。

1.3.4 仪器条件

1.3.4.1 高效液相色谱-串联质谱条件

色谱条件：色谱柱：ZORBAX Eclipse Plus C18（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）；柱温30 ℃；进样体积5 μL；流动相：A为甲酸-水溶液（1∶99，V/V），B为乙腈；流速0.40 mL/min。洗脱梯度见表1。

表1 梯度洗脱程序Table 1 Gradient elution program

质谱条件：电喷雾离子源（e l e c t r o n s p r a y ionization，ESI），喷雾电压3 500 V，辅助气气化温度300 ℃，鞘气流速12 mL/min，鞘气温度350 ℃。多反应监测质谱参数见表2。

表2 异丙嗪多反应监测质谱参数Table 2 Mass spectrometric parameters in MRMmode for promethazine

1.3.4.2 高分辨液相色谱-质谱条件

色谱条件同1.3.4.1节，高分辨质谱条件：离子源参数：辅助气温度320 ℃；鞘气压力4 arb；辅助气压力15 arb；Scan分辨率120 000；二级分辨率60 000。扫描离子见表3。

表3 异丙嗪高分辨质谱参数Table 3 QE MS parameters for promethazine

2 结果与分析

2.1 色谱条件优化

异丙嗪为弱极性化合物，在C18柱上有较好的保留，且相对于C8色谱柱，C18柱对弱极性化合物中极性更强的一类化合物有更好的保留分离效果。异丙嗪含有氨基，容易失去H+得到[M+H]+型分子离子峰，因此选取ESI+模式检测；通过对比乙腈+水、乙腈+甲酸溶液（0.1%）、甲醇+水、甲醇+甲酸溶液（0.1%）等不同流动相类型，发现在正离子模式下乙腈+甲酸溶液（0.1%）作为流动相可以得到较好的目标物分离度及峰形，水相中加入0.1%甲酸，降低了流动相的pH值，有助于目标物的离子化，从而提高了目标物响应值。在ESI+模式下，得到准分子离子峰[M+H]+，并对离子源参数进行优化，再以准分子离子为母离子，通过氮气碰撞产生碎片离子进行二级质谱扫描，得到稳定的碎片离子作为子离子；以此为定性依据，然后优化碰撞电压及碰撞能量。由图2可以看出，异丙嗪在肉类基质中得到有效分离且响应值满足实验要求。

图2 异丙嗪总离子流图及定量和定性离子流图Fig. 2 Total ion current chromatograms and MRM chromatograms of quantitative and qualitative ion pairs

2.2 提取条件优化

异丙嗪易溶于水和乙腈，对比了加标量为2 μg/kg，乙腈、含0.1%甲酸的乙腈溶液、含10%水的乙腈溶液作为提取溶剂的回回率。图3表明：乙腈作为提取溶剂时[25-26]，由于其极性较强，更容易提取出样品中的杂质；相比于乙腈+水，用酸化乙腈作提取溶剂时，异丙嗪可以得到更好的提取效率，且不会引入过多的杂质，回回率最高。故本实验选取酸化乙腈作为异丙嗪残留量检测的提取溶剂。

图3 提取溶剂对回收率的影响Fig. 3 Effect of extraction solvents on the recovery of promethazine

2.3 净化条件的选择与优化

由于异丙嗪属于脂溶性化合物，同时在畜肉及其内脏基质含有大量蛋白质及脂肪，不宜选用液液萃取[27]作为净化方式，因此需选取固相萃取柱对其进行除杂。实验选取HLB、C18、MCX、PEP四种SPE净化柱进行比对，发现由亲脂性二乙烯苯和亲水性N-乙烯基吡咯烷酮填料组成的HLB固相萃取柱相较于其他固相萃取柱在稳定性、净化效果以及蛋白、脂肪等杂质的去除方面都有很大优势，对比2 μg/kg添加量目标化合物的回回率结果，HLB柱优于C18柱、MCX柱及PEP柱（图4）。故本实验选取HLB柱作为净化小柱。

图4 SPE柱对回收率的影响Fig. 4 Effect of SPE columns on the recovery of promethazine

2.4 方法学结果

2.4.1 基质效应

基质效应是由于与被分析物一起流出的其他内源性物质造成的，例如盐类、胺类、脂肪酸、甘油酸酯等，这些干扰物与目标化合物共同流出喷雾针可影响待分析物的雾化、挥发、裂分、化学反应及带电过程，导致进入质谱的离子减少（离子抑制）或增多（离子增强），从而影响定量结果的可靠性和准确性[28-29]。

通过绘制溶剂标准曲线和基质匹配标准曲线，采用基质效应评价畜肉及其内脏的基质效应大小[30]。

基质效应/%=[（基质匹配标准曲线的斜率-溶剂标准曲线的斜率）/溶剂标准曲线的斜率]×100

其中，-20%＜基质效应＜+20%，基质效应处于抑制状态；-50%＜基质效应＜-20%，+20%＜基质效应＜+50%，基质效应为中等效应，基质效应处在不会增强或抑制状态；基质效应＜-50%，基质效应＞+50%，基质效应是增强状态。

由结果可见，异丙嗪的基质效应为-74%，表明本实验的基质效应会对实验结果产生影响，因此需要通过配制基质标准曲线扣除基质带来的影响。

2.4.2 线性与检出限和定量限

配制空白基质标准曲线，添加质量浓度为0.5、1.0、5.0、10.0、20.0、50.0 ng/mL，得到异丙嗪在6 个质量浓度水平下绘制的线性方程，相关系数在0.999以上，线性范围良好。以3 倍信噪比及10 倍信噪比确定检出限及定量限分别为0.1 μg/kg和0.3 μg/kg，结果见表4。

表4 异丙嗪的回归方程、相关系数、检出限、定量限Table 4 Regression equation, correlation coefficient, LOD and LOQ of promethazine

2.4.3 回回率及精密度

选取5 种不同空白基质样品，称样量5.0 g左右，分别添加0.2、1.0、5.0 μg/kg水平后测定，做6 次平行实验，结果见表5。结果表明不同基质的添加回回其回回率在85.7%～102.0%之间，相对标准偏差在0.9%～7.4%之间，均符合GB/T 27404—2008《实验室质量控制规范 食品理化检测》中要求。

=6）Table 5 Recoveries for promethazine in different spiked samples (n= 6)表5 不同基质中加标回收率结果（n

2.5 高分辨液相色谱-质谱法定性筛查

基于实际检测过程中发现的问题，异丙嗪等噻吩嗪类药物在检测过程中容易受到基质的影响干扰而影响质谱的确证，因此建立高分辨筛查方法有助于对目标物的确认。通过基质标准曲线的异丙嗪化合物精确分子质量确认实际检测样品中的异丙嗪存在情况。通过图5可以得到异丙嗪在肉类基质中的精确分子质量，且不会受附近同分异构体化合物的干扰，达到有效确证的目的。

图5 高分辨谱图Fig. 5 High resolution spectrogram

2.6 阳性样品筛查

通过本方法对市售的100 件畜肉及其内脏产品进行检测，样品囊括牛、羊、猪肉等及其副产品，结果在30 件牛、羊肉样品中检出异丙嗪，含量为2.0～5.2 μg/kg，通过高分辨比对发现均为异丙嗪目标物，其余样品均为检出。

3 结 论

本实验建立了一种适用于肌肉、肾脏、肝脏等多种基质中异丙嗪的高效液相色谱-串联质谱检测方法。该方法操作简单、快速、准确性好，检测限低、灵敏度高，同时辅助高分辨质谱分析方法确证目标化合物，可应用于异丙嗪的分析检测。本方法的建立，弥补了当前国标的缺失，为打击注水肉的不法行为提供了有效的监测有段。