嵌合抗原受体修饰T细胞治疗前列腺癌的研究进展

尤祥云，向振东，易成，张满，喻俊峰△

在欧美国家，前列腺癌（prostate cancer，PCa）是男性常见的恶性肿瘤，其发病率在男性中居首位，病死率仅次于肺癌和结直肠癌［1］。在我国，男性癌症中前列腺癌发病率和病死率增长最快［2］。目前，临床上多采用阻断雄激素及其信号通路的方法来治疗晚期前列腺癌，然而在这种雄激素剥夺治疗（androgen deprivation therapy，ADT）18～30个月后，大多数患者会进展为去势抵抗性前列腺癌（castration resistant prostate cancer，CRPC）［3］。CRPC 阶段的前列腺癌治疗手段有限，预后较差。免疫治疗是一种全新的治疗方式，通过调节人体免疫系统达到杀伤肿瘤细胞的目的，可在一定程度上改善部分前列腺癌患者的预后［4］。其中，嵌合抗原受体修饰T细胞（chimeric antigen receptor modification T cells，CART）在治疗急、慢性淋巴细胞白血病和非霍奇金淋巴瘤等血液系统恶性肿瘤治疗中已经取得了显著的临床疗效［5］。本文就CAR-T在前列腺癌中的最新研究进展作一综述，以期为临床提供参考。

1 CAR-T的结构与功能

CAR-T指通过基因工程融合技术，使患者T细胞表面表达特定的抗原受体，以此来识别靶细胞上特异性抗原，从而发挥抗肿瘤作用的一种免疫治疗方法［6］。CAR-T一般由细胞外抗原识别区、跨膜区和细胞内信号转导区3部分组成，细胞外抗原识别区是CAR-T特异性识别肿瘤抗原的基础，由单链可变区序列（single chain variable fragment，scFv）组成，可以特异性地识别肿瘤相关抗原（tumor associated antigen，TAA），对肿瘤细胞的杀伤绕过了抗原递呈阶段而不涉及主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）；跨膜区通常由T细胞抗原受体分化簇（cluster of differentiation，CD）3ζ、CD8、CD28等构成，能修复T细胞表面的scFv并将信号转导到细胞，在T细胞的活化过程中起着重要作用；胞内信号区的主要作用是激活T细胞，常用的分子为CD3、CD28、CD27、CD137等［7］。

目前，CAR结构研究已经到了第4代。第1代CAR的结构是在细胞外抗原识别区scFv的基础上引入了CD3作为细胞外抗原识别区，这些CAR结构允许T细胞活化，但由于缺乏共刺激分子，其抗肿瘤活性并不高，在血液循环中的持续时间不够长［8］；第2代CAR在第1代的基础上加入了如CD28或CD137共刺激分子结构域，提高了CAR-T在人体内对抗肿瘤组织微环境及肿瘤杀伤能力［9］；第3代CAR能够搭载多个共刺激分子结构域，使得CAR-T的增殖活性和细胞因子释放量均明显增加，能有效延长其在体内的生存时间［10］；第4代CAR具有共刺激分子结构域和促炎因子，如白细胞介素（interleukin，IL）-2，另外在第3代CAR结构的基础上进行了其他改进，如通过增加编码CAR的基因及其启动子的载体以提高其效应［11］。然而，目前CAR结构虽然已研究到第4代，但主要应用研究方向是在血液系统，在前列腺癌中的治疗还停留在第2代和第3代。

2 前列腺TAA在前列腺癌CAR-T治疗中的应用

前列腺TAA的鉴定是开发有效CAR-T治疗的第一步，理想的TAA应是仅在癌细胞中特异性表达，使CAR-T在肿瘤组织可产生特异性免疫反应而不损伤正常组织［12］。前列腺癌细胞表达的TAA有前列腺特异性膜抗原（prostate specific membrane antigen，PSMA）、前列腺干细胞抗原（prostate stem cell antigen，PSCA）、前列腺特异性抗原（prostate specific antigen，PSA）及前列腺酸性磷酸酶（prostate acid phosphatase，PAP），故可将前列腺TAA作为前列腺癌CAR-T治疗中诱导免疫应答的靶点［13］。

2.1 PSMA PSMA是一种跨膜糖蛋白，在前列腺组织中高表达，在乳腺、肾、结肠和肝细胞中仅少量表达［14］。研究显示，PSMA在前列腺癌中的表达水平随着前列腺癌Gleeson评分的增加而升高，在CRPC中尤为突出，是前列腺癌患者不良预后的预测因素［15］。PSMA在CAR-T治疗中的作用越来越突出。Zuccolotto等［16］用PC3-PIP细胞构建小鼠前列腺癌模型，用以PSMA为靶点的第2代CAR-T细胞进行治疗，通过定量生物荧光法检测发现，经过CAR-T输注治疗1周后治疗组（其CAR-T含有识别PSMA的scFv）小鼠瘤体体积不再增大，治疗组小鼠中位生存期较对照组（CAR-T不含有识别PSMA的scFv）明显延长。Ma等［17］用PC-3细胞构建小鼠前列腺癌模型，对比了普通T细胞、以PSMA为靶点的第1代和第2代CAR-T治疗前列腺癌的效果：在体外实验中发现，第2代CAR-T治疗的抗原诱导效应、T细胞活化增殖作用和T细胞毒性作用均高于第1代CAR-T和普通T细胞；在裸鼠皮下成瘤的动物体内实验中，用第2代CAR-T治疗的小鼠在27 d后75%的小鼠（6/8）皮下移植瘤基本消失，治疗效果明显优于第1代CAR-T（1/8）和普通T细胞（0/8）治疗方案。

免疫反应的抑制会减弱CAR-T治疗效果，例如转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）有促进肿瘤细胞迁移和招募调节性T细胞（regulator cell，Treg）等抑制免疫细胞功能的作用。Zhang等［18］用慢病毒转染方法开发了以PSMA为靶点的CAR-T，其CAR结构中含有抗TGF-β的基因，可防止TGF-β产生免疫抑制，结果亦显示CAR-T显著提高了T细胞对肿瘤的杀伤作用并削弱了肿瘤细胞的侵袭能力。

程序性细胞死亡蛋白-1（programmed death-1，PD-1）及其配体（PD-L1）也会抑制免疫细胞的激活。Serganova等［19］用Myc-CaP细胞构建了小鼠前列腺癌模型，通过以PSMA为靶点的第2代CAR-T联合PD-1抗体进行治疗，结果显示不表达PSMA的前列腺癌模型组肿瘤继续进展，而表达PSMA的前列腺癌模型组肿瘤生长受到抑制，表明CAR-T细胞治疗具有靶点抗原依赖性，CAR-T联合其他免疫治疗方案可增强前列腺癌治疗效果。

IL-2能刺激活化的T细胞增殖，增强机体的免疫应答。Junghans等［20］在一项Ⅰ期临床试验中，对5例患者进行以PSMA为靶点的CAR-T细胞治疗，并连续4周注射低剂量IL-2［75 000 IU/（kg·d）］，结果显示血清IL-2水平越高，CAR-T的抗肿瘤作用越强，其中2例患者血清PSA水平分别降低50%和70%，另外3例患者也获得部分缓解。此外，另一临床前试验研究中使用了第2代基于CD28的以PSMA为靶点的CAR-T治疗，4例患者中有1例病情稳定，无进展生存＞6个月，1例无影像学进展＞16个月，还有2例患者CAR-T细胞治疗无效且病情有进展［21］。

PSMA是前列腺癌免疫治疗研究的重要靶点，将CAR-T治疗与其他治疗方案结合的联合治疗方案能够发挥更好的抗前列腺癌作用。

2.2 PSCA PSCA是一种在前列腺癌细胞中特异性表达的细胞表面糖蛋白，其在癌组织中的表达水平随着前列腺癌的进展而逐渐升高，在前列腺癌骨转移中100%表达［22］。由于PSCA在前列腺组织中表达的特异性且其不会释放入血液，因此成为前列腺癌靶向治疗的重要靶点。Hillerdal等［23］用慢病毒转染方法开发了以PSCA为靶点的第3代CAR-T，并应用于小鼠前列腺癌模型的治疗中，在体外实验中发现CAR-T与靶细胞PSCA特异性结合后分泌大量IL-2和干扰素（interferon，INF），并可有效杀伤肿瘤细胞；在体内实验中发现，实验组（其肿瘤细胞表达PSCA）相对于对照组（其肿瘤细胞不表达PSCA），CAR-T治疗能有效减缓肿瘤体积的增长速度，小鼠总生存期明显延长。Priceman等［24］采用以PSCA为靶点的第2代CAR-T治疗PC-3和DU145细胞构建的小鼠前列腺癌细胞模型，发现含CD137共刺激分子的CAR-T对肿瘤抗原诱导效应和T细胞活化增殖作用比含CD28共刺激分子的CAR-T高，且两者在抗肿瘤的作用相近时，含CD137共刺激分子的CAR-T细胞对T细胞的耗竭程度更小；在来自CRPC患者的移植瘤模型中发现，含CD137共刺激分子的CAR-T治疗抗肿瘤作用更强。目前，以PSCA为靶点的CAR-T治疗的机制研究虽然越来越深入，但多还停留在细胞和动物实验阶段，其临床效果还待进一步探讨。

2.3 PSA PSA是前列腺癌最常见的生物标志物，由前列腺囊泡和导管上皮细胞分泌，可在前列腺组织、血清和精液中检测到［25］。正常情况下，血清PSA水平极低，在前列腺组织结构受到破坏（如前列腺增生挤压或前列腺癌肿瘤细胞破坏）时，PSA由前列腺腺泡通过毛细血管进入血液［26］。CAR-T治疗中，PSA具有前列腺组织特异性，是将药物递送到肿瘤组织良好靶点。然而，由于在前列腺组织结构受到破坏时血清中也可能存在PSA，如何避免CAR-T作用于血清中的正常细胞仍然是一个难题。Mikolajczyk等［27］研究表明，游离前列腺特异性抗原（free prostate specific antigen，fPSA）有良性前列腺特异性抗原、非活性前列腺特异性抗原和PSA前体（pro-prostate specific antigen，pro-PSA）3种亚型，其中pro-PSA在前列腺癌细胞中的表达水平较其他2种亚型更高，有望成为CAR-T细胞治疗前列腺癌较为合适的靶点。

2.4 PAP PAP是前列腺癌的另一种肿瘤标志物，在前列腺癌细胞中分泌明显增多。研究显示，前列腺癌骨转移的患者PAP表达水平显著升高，与PSA相比PAP可准确判断前列腺癌的微转移，并可作为CRPC患者的免疫治疗靶点［7］。然而，PAP不仅在前列腺癌和前列腺癌组织中表达，在小肠癌、胰腺内分泌癌和膀胱癌中也有一定量表达，因此以PAP为靶点的CAR-T细胞治疗的特异性较差。

2.5 其他 部分在前列腺组织中特异性表达的蛋白或者肽类也可作为前列腺癌CAR-T细胞治疗中诱导免疫应答的靶点。Tsavaler等［28］研究显示，瞬时受体蛋白（transient receptor potential，Trp）-p8在前列腺癌和其他恶性肿瘤中表达均上调，有可能作为前列腺癌治疗的良好靶点。另外，上皮特异性黏附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）大量表达于快速增长的上皮性或上皮源性肿瘤组织中，已成为肿瘤早期诊断和免疫靶向治疗的候选分子。目前，在前列腺癌CAR-T细胞治疗的研究中，第2代以EpCAM为靶点的CAR-T的临床前试验研究（NCT03013712）正在进行中。

3 展望

CAR-T在前列腺癌的治疗中仍然面临着许多挑战，如CAR-T一旦进入肿瘤通常会面临缺乏营养和氧气、pH值低、高钾等不利的肿瘤免疫微环境（tumor micro environment，TME）［29］。更好地设计和完善CAR-T的细胞结构来抵消TME的影响是CAR-T细胞改进和突破的一个重要方向。目前，第4代CAR-T可通过增加编码CAR的基因及其启动子的载体诱导表达IL-8或IL-2来改变TME，增强疗效［30］。另外，CAR-T治疗还存在细胞因子释放综合征（cytokine release syndrome，CRS）、神经毒性以及过敏反应等毒性反应［31-32］。因此，CAR-T联合其他免疫疗法或多类型CAR-T联合治疗以减少其毒性反应也是未来的研究发展趋势。