九香虫血淋巴不同保存温度下的稳定性评价

赵帅 于梅 檀军 蔡仁莲 田莹 郭建军

摘 要：九香虫是一种传统药用昆虫，其血淋巴具有抗癌、抗菌作用，也可用以治疗婴儿血管瘤等，其抗癌活性物质主要为多肽。但九香虫血淋巴在不同保存条件下稳定性较差，易产生不溶性沉淀，导致其总蛋白含量变化以及抗癌活性变动。本文通过对常规保存温度（4、-20、-80℃）下的九香虫血淋巴产生不溶性沉淀及总蛋白含量的测定，并通过体外MTT法，检测不同处理的九香虫血淋巴的体外抗癌活性，以评价九香虫血淋巴的稳定性。结果显示，-80℃下保存的血淋巴产生不溶性沉淀量相对较少，总蛋白含量在14d首次取出无显著变化，不同处理的九香虫血淋巴均能明显抑制乳腺癌细胞的生长，-80℃抗癌活性相对稳定。综上，-80℃温度下较适合九香虫血淋巴的保存。

关键词：九香虫;血淋巴;总蛋白;沉淀;抗癌活性

Abstract：Aspongopus chinensis is a traditional medicinal insect， and its hemolymph has anti-cancer and anti-bacterial effects. It can also be used to treat hemangioma etc. But A.chinensis hemolymph is less stable under different storage conditions， and it is easy to produce insoluble precipitation， which leads to changes in its total protein content and anti-cancer activity. In this paper， the total protein content and precipitation of the hemolymph under different temperatures （4，-20，-80℃） were observed continuously. The anti-cancer activity in vitro of the hemolymph with different treatments by MTT method， and the hemolymph stability of A.chinensis was evaluated. The results showed that the amount of insoluble precipitation produced by hemolymph was relatively small when stored at -80℃. Total protein content was not significantly changed when the hemolymph was first removed after 14 days. The hemolymph treated with different treatments could significantly inhibit the growth of breast cancer cells， and the anticancer activity was relatively stable at -80℃. To sum up， the temperature of -80℃ is more suitable for the preservation of hemolymph of A.chinensis.

Keywords：Aspongopus chinensis; hemolymph; total protein; precipitation; anti-cancer activity

九香蟲Aspongopus chinensis，为一味传统中药，始记载于《本草纲目》，主治膈脘滞气，脾肾亏损，壮元阳，等。2015年版中国药典，九香虫以药材和饮片类别写入，具理气止痛，温中助阳功效。现代药理学研究显示，九香虫血淋巴能显著抑制人胃癌细胞SGC-7901、人乳腺癌细胞MCF-7的体外生长，并可诱导癌细胞凋亡[1-5]，同时临床应用其可治愈血管瘤[6-7]，研究显示其抑癌活性组分主要存在于血淋巴，主要抗癌活性物质为蛋白多肽类[8-9];Tan等[10]从九香虫血淋巴中分离出一种稳定性较好的多肽类物质，耐高温且抗癌活性良好。

笔者在试验过程中发现，九香虫血淋巴稳定性较差，易产生不溶性沉淀，从而引起总蛋白含量易发生变化和抗癌活性变动等问题。本研究通过测定不同储存条件下九香虫血淋巴的蛋白质含量及体外抗癌活性的变化，探讨不同储存条件下不溶性沉淀的产生对九香虫血淋巴稳定性及抗癌活性的影响，以期为中药材九香虫血淋巴的进一步研究选择保存方式提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 虫源

九香虫采集于贵州省凯里市（E107.80°，N26.52°），清水清洗干净后，保存于-80℃冰箱，备用.

1.1.2 癌细胞

4T1小鼠乳腺癌细胞购于中国科学院细胞库，培养在RPMI-1640培养液中，置于37℃、5%CO2的恒温培养箱中培养在细胞培养箱中，备用。

1.2 试验试剂

RPIM-1640培养液和丙酮酸钠溶液购于美国Gibco公司，0.25%胰酶购于美国HyClone公司，胎牛血清购买于浙江天杭生物科技股份有限公司，PBS缓冲液购于上海生工生物工程股份有限公司，青链霉素购于北京索莱宝科技有限公司，碳酸氢钠（分析纯）购于天津市永大化学试剂有限公司，葡萄糖（分析纯）购于成都金山化学试剂有限公司，Bradford蛋白浓度测定试剂盒、蛋白酶抑制剂混合物购于上海碧云天生物技术有限公司，二甲基亚砜（DMSO）购于美国Amresco公司，噻唑蓝（MTT）购于美国Sigma公司。

1.2 实验方法

1.2.1 九香虫血淋巴的制备及保存

九香虫去除头、胸部，腹部置于5mL一次性针管中，物理按压，得到九香虫腹腔内容物;4℃，13000×g离心15min，取中间层暗红色液体;4℃，10000×g离心10min，取上层液体得九香虫血淋巴;加入蛋白酶抑制剂，0.45μm微孔滤膜除菌;滤出液即为九香虫血淋巴，分别保存于4℃、-20℃（青岛海尔股份有限公司，BCD-440WDPG）、-80℃冰箱（Thermo scientific，Forma 900 series）内备用。每个温度下三个重复，记为4-1，4-2，4-3，-20-1，-20-2，-20-3，-80-1，-80-2，-80-3。

1.2.2 不同保存温度下九香虫血淋巴沉淀及总蛋白变化

九香虫血淋巴4℃，10000×g离心10min，电子天平（上海卓精电子科技有限公司，BSM-520.3）称量每次沉淀质量，上清液0.45μm微孔滤膜除菌后Bradford法测定总蛋白含量。具体方法为4-1、-20-1和-80-1在第2天首次从冰箱拿出，低温离心取沉淀称重，取血淋巴液体测定吸光度，根据Bradford蛋白浓度测定试剂盒说明书制作的蛋白标准曲线计算总蛋白含量，分别在6、14、21、28天重复上述操作计算沉淀重量和总蛋白含量。4-2、-20-2和-80-2在第6天首次从冰箱拿出，后续操作同上。4-3，-20-3和-80-3在第14天首次从冰箱拿出，后续操作同上。

1.2.3 细胞培养

小鼠乳腺癌细胞4T1培养在RPMI-1640培养液中，置于37℃、5%CO2的恒温培养箱中，培养液中添加10%的胎牛血清，碳酸氢钠1.5g/L，葡糖糖2.5g/L，丙酮酸钠0.11g/L，1%的青链霉素。细胞铺满培养瓶约80%后，用0.25%胰酶消化传代。

1.2.4 MTT法测定体外药效的变化

细胞胰酶消化制成单细胞悬液，调整细胞密度为5×104个/mL，接种于96孔细胞培养板，每孔100μL，24h待细胞贴壁后开始给药，以蛋白含量设置药物梯度，0、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25mg/mL，每个浓度设置5孔，48h后测定570nm下的吸光度，计算经九香虫血淋巴处理的4T1细胞活力，SPSS17.0计算半数致死浓度IC50值。

细胞活力=[（试验组吸光度-空白组吸光度）/（对照组吸光度-空白组吸光度）]×100%

1.2.5 数据分析

数据均采用均值±标准差表示。试验数据用SPSS 17.0进行分析，不同组之间采用单因素方差分析比较差异性，P<0.05为具有显著差异性。

2 结果与分析

2.1 九香虫血淋巴的沉淀产生情况

九香虫血淋巴放置在不同温度条件下，均有沉淀产生，且每个存放时间点首次取出血淋巴产生的沉淀均无规律性，在2、6、14d时，4℃下首次取出沉淀质量分别为0.080、0.090、0.162g递增趋势，-20℃下首次取出沉淀质量分别为0.098、0.086、0.119g，先减少后增加，出现不稳定情况，-80℃下沉淀质量为0.070、0.046、0.028g，递减趋势;在同一天取出的血淋巴，2、6、14、21d产生的沉淀结果显示，取出次数多的沉淀质量均少于取出次数少的，28d的沉淀质量结果不同于上述规律;另外4、-20、-80℃总的沉淀质量分别为0.494、0.479、0.325g，显示在-80℃冰箱的九香虫血淋巴沉淀最少，且取出次数越少，产生沉淀（0.083<0.099<0.143）越少（表1）。

2.2 九香虫血淋巴总蛋白含量的变化

九香虫血淋巴放置在不同温度条件下，均出现总蛋白含量的变化。九香虫血淋巴最初总蛋白含量为41.89±0.78mg/mL，在2、6、14d首次取出血淋巴總蛋白含量结果显示，与0d总蛋白含量相比，-20-1（P=0.910）在第6d时无显著性差异，4-2（P=0.169）和-20-2（P=0.081）在第14d时无显著差异，-20-3（P=0.282）和-80-3（P=0.741）在14d首次取出的总蛋白含量无显著差异，其他情况均有较大程度的下降，差异极显著（P<0.001），-80℃下保存14d非首次取出的血淋巴总蛋白含量（P<0.001）大于初始总蛋白含量，差异极显著（表2）。

2.3 九香虫血淋巴体外抗癌活性的评价

最初提取的血淋巴，对其进行体外抗癌活性检测（图1），与对照组相比，不同蛋白浓度的九香虫血淋巴均极显著抑制细胞的增殖（P<0.001），并且呈剂量依赖性，计算得出IC50值是0.131mg/mL。

在第2天时首次取出4、-20、-80℃冰箱储存的血淋巴，进行体外抗癌活性的评价（图2）。结果显示，与对照组相比，不同浓度的九香虫血淋巴对小鼠乳腺癌细胞的增殖均有极显著的抑制效果（P<0.001），与4℃保存的血淋巴作用于细胞的效果比较，在血淋巴浓度为0.05mg/mL时，-20℃的抑制效果有极显著降低（P<0.001），-80℃的抑制效果有显著降低（P<0.05），在血淋巴浓度为0.1mg/mL时，-20℃的抑制效果有极显著降低（P<0.001）。在4、-20、-80℃温度下保存的九香虫血淋巴作用于体外乳腺癌细胞的IC50值分别为0.042、0.061、0.046mg/mL。

在第6天时首次取出4、-20、-80℃冰箱储存的血淋巴，进行体外抗癌活性的评价（图3）。结果显示，与对照组相比，不同浓度的九香虫血淋巴对小鼠乳腺癌细胞的增殖均有极显著的抑制效果（P<0.001），与4℃保存的血淋巴作用于细胞的效果比较，在血淋巴浓度为0.05mg/mL时，-80℃的抑制效果有显著降低（P<0.05），在血淋巴浓度为0.15mg/mL时，-80℃的抑制效果有极显著降低（P<0.001）。在4、-20、-80℃温度下保存的九香虫血淋巴作用于体外乳腺癌细胞的IC50值分别为0.011、0.016、0.014mg/mL。

在第14天時首次取出4、-20、-80℃冰箱储存的血淋巴，进行体外抗癌活性的评价（图4）。结果显示，与对照组相比，不同浓度的九香虫血淋巴对小鼠乳腺癌细胞的增殖均有极显著的抑制效果（P<0.001），与4℃保存的血淋巴作用于细胞的效果比较，在血淋巴浓度为0.1mg/mL时，-20℃的抑制效果有极显著降低（P<0.01），在血淋巴浓度为0.15mg/mL时，-20℃的抑制效果有极显著降低（P<0.001）。在4℃、-20℃和-80℃温度下保存的九香虫血淋巴作用于体外乳腺癌细胞的IC50值分别为0.021、0.022、0.017mg/mL。

上述抗癌活性结果中，在0.05、0.1、0.1mg/mL浓度下出现显著性差异（P<0.05），因此，对不同温度下的这三种浓度在不同时间对细胞的作用情况进行统计学分析，结果显示仅在-80℃下0.15mg/mL浓度下，第6、14天无显著性差异（P=0.423），其余情况下均有显著性差异（P<0.05），且相比较4、-20℃温度下，-80℃温度下九香虫血淋巴抗癌活性（第2、6、14天）相对变化较小（图5）。

3 结论与讨论

九香虫作为广泛应用的一味传统中药，具有良好的抗癌活性。本研究旨在探究九香虫血淋巴的不溶性沉淀的产生对其总蛋白含量及抗癌活性的影响，以期找出九香虫血淋巴的较适保存温度。

小鼠乳腺癌细胞系4T1是一种高度恶性，高自发转移的细胞系，接种Balb/c小鼠后，可自发形成具有高转移肿瘤，自发转移至肺等，在肿瘤发生、转移上与人类乳腺癌相似[11-14]，是乳腺癌研究中常用的三阴性乳腺癌细胞系。

前期研究结果表明，九香虫血淋巴的抗癌活性物质主要为蛋白质[8-10]，故本研究选择血淋巴总蛋白含量作为判断稳定性的指标之一，此外，本研究选择了血淋巴产生的沉淀量作为另一个指标。本文研究表明，存放于不同温度下的血淋巴均会产生不同质量的沉淀，相对而言，储存于-80℃冰箱中的血淋巴所产生的沉淀较少，且取出次数越少，沉淀质量越小;总蛋白含量方面，在14d时首次取出保存在-20℃和-80℃下总蛋白含量与初始无显著差异，综上所述，九香虫血淋巴的较优条件为保存在-80℃冰箱，并且尽量分装，避免反复冻融。九香虫血淋巴不同处理体外抗癌活性的评价显示，不同浓度九香虫血淋巴对乳腺癌细胞均有极显著的抑制生长增殖的效果，并且与初始血淋巴的体外抗癌活性相比，保存于不同温度下的九香虫血淋巴，体外抗癌活性进一步提高，结果显示总蛋白质含量的下降并不能降低血淋巴的体外抗癌活性，提示九香虫血淋巴可能存在某一类抗癌活性蛋白不易降解，或者九香虫血淋巴存在某一类抗癌活性物质的前体，后期进一步活化而使九香虫血淋巴的抗癌活性进一步增强。在第6天时抗癌活性基本上达到最强，提示九香虫血淋巴中沉淀产生，可能导致其中的抗癌活性物质浓度升高，从而抑制细胞的作用加强，后期的细胞抑制作用减弱，可能是抗癌活性物质的部分降解引起的。而在第6天时，-80℃下的血淋巴相对减弱了抑制细胞的作用，原因可能是相比4、-20℃产生的沉淀较少，抗癌活性物质的浓度相对低于4、20℃，这也从另一方面说明了保存在-80℃的血淋巴相对稳定。

综上，本研究结果表明，九香虫血淋巴稳定性较差，但并不影响其血淋巴体外的抗癌活性，保存于-80℃的九香虫血淋巴的稳定性和抗癌活性稳定性较好，本研究结果可为九香虫资源的进一步开发利用提供参考。

参 考 文 献：

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