ELISA联合NAT技术在献血者血液筛查和输血残余风险分析中的应用

陈红霞

广东省惠州市中心血站(惠州 516003)

临床用血主要来源于献血，献血者的血液筛查对于保证用血安全具有重要意义，采取科学的血液筛查方法能够降低输血残余风险[1]。目前献血者的血液筛查主要采用两次酶联免疫法(ELISA)检测，但是因为乙肝病毒(HBV)、丙肝病毒(HCV)、艾滋病毒(HIV)等感染存在一定窗口期或病毒变异、免疫静默等，易导致部分病毒感染者ELISA检测结果呈阴性，造成病毒漏检、漏诊，影响临床输血安全，存在输血残余风险[2]。核酸检测技术(NAT)是近年来应用于临床中的一种病毒核酸筛查方法，能在人体感染HBV、HCV、HIV后短期内检测出血液标本中含量极少的病毒DNA[3]，能在最大程度上缩短病毒检测的“窗口期”，弥补ELISA检测方法的不足[4]。2015年我国《血站技术操作规程》[5]推荐将ELISA、NAT联合应用，为提升献血者血液筛查准确性奠定基础。作为医疗机构的血液供应单位，面临患者用血安全问题，更应支持两种方法的“双保险”检测。本次选取我中心血站2 514例无偿献血者的血液标本分别采用ELISA、NAT技术检测，分析ELISA、NAT技术联合应用价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料

本次研究选取2019年1月—8月惠州市中心血站2 514例无偿献血者为研究对象，其中男1 305例，女1 209例；年龄18～57岁，平均(29.31±4.57)岁。所有献血者均经《献血者健康检查要求》(准GB 18467- 2011)[6]中的相关规定进行初筛，符合献血标准后献血。

1.2 检测方法

平行采集每位献血者2管血液，各5 mL，1管以EDTA-K3真空抗凝管保存，作为ELISA检测标本，1管以EDTA-K2真空抗凝管保存，作为NAT技术检测标本，均在2 ℃～8 ℃环境中保存，并于3 h内做离心处理、24 h内完成检测。

1.2.1 ELISA法检测 以ELISA法检测乙肝病毒表面抗原(HBsAg)、丙肝抗体(抗-HCV)、艾滋病抗体(抗-HIV)，检测方法及步骤严格遵循卫生部门相关规定。分别应用不同厂家的试剂盒重复检验2次，试剂盒来源(见表1)。检验前先做HBsAg胶体金快速筛查以减少血液报废，合格后再采血、留样。ELISA法检测前，使用全自动加样机加样、设置阴性对照和阳性对照、确定标准质控品，并以一次性加样尖加样；使用全自动酶免分析仪检测进行后处理，所有试剂都应用扫描条形码方式。阳性判定标准：①两个商家的试剂盒检测均为阳性；②一个试剂盒检测为阳性，再次用此种试剂进行双孔复测试管仍然有≥1孔为阳性。其中HBsAg、抗-HCV 80%灰区为阳性，抗-HIV70%灰区为阳性。

表1 ELISA检测试剂盒

1.2.2 NAT技术检测 具体检测步骤如下：①以磁珠捕获技术制备样本，分离HBV DNA、HCV RNA、HIV RNA；②做逆转录处理，将RNA转化为互补DNA(cDNA)；③以聚合酶链反应(PCR)扩增、特异性荧光探针检测cDNA；④根据反应管中荧光信号达到预先设定域值时的循环阈值(Ct)判定结果，Ct<40为阳性，Ct≥55为阴性，Ct为40～50需要重新测量。

1.2.3 标本追踪 ELISA检测阴性，而NAT检测阳性者，再次采集血样检测HBsAg、抗-HCV、抗-HIV，并于第1 d、3 d、7 d、14 d、21 d、28 d进行采样追踪，检测HBsAg、抗-HCV、抗-HIV。

1.3 观察指标

分别统计ELISA检测、NAT技术检测结果，将ELISA检测结果与ELISA联合NAT技术检测结果进行对照分析。

2 结 果

2.1 ELISA检测结果

ELISA检测结果显示27例阳性，阳性率1.07%，其中2例同时HBsAg阳性、抗-HCV阳性。HBsAg阳性率0.52%，抗-HCV阳性率0.36%，抗-HIV阳性0.28%。见表2。

表2 ELISA检测结果 n=2 514

2.2 NAT技术检测结果

NAT技术检测结果显示12例阳性，阳性率0.48%，其中1例同时HBV DNA阳性、HCV RNA阳性。HBV DNA阳性率0.28%，HCV RNA阳性率0.16%，HIV RNA阳性率0.08%。见表3。

表3 NAT技术检测结果 n=2 514

2.3 ELISA与NAT检测结果对比

27例ELISA检测阳性中，10例经NAT技术检测证实为阳性，17例为阴性；2 487例ELISA检测阴性中，2例NAT技术检测HBV DNA阳性，2 485例为阴性。见表4。

对2例ELISA检测检测阴性、NAT技术检测阳性者重新采集血样再次检测HbsAg仍为阴性，进行随访追踪，其中1例追踪至第7d HbsAg阳性，另1例追踪至28 d HbsAg阳性，证实为窗口期HBV感染。以ELISA联合NAT技术为标准，2次ELISA检测的敏感度为83.33%(10/12)，特异度为99.32%(2 485/2 502)，检测总准确性为99.24%(2 495/2 514)。

表4 ELISA与NAT检测结果对比

3 讨 论

提升献血者血液筛查质量是提升用血安全、降低输血残余风险的基础。以往多采用ELISA进行血液筛查，2015年我国《血站技术操作规程》[5]推荐将ELISA、NAT联合应用，然而此种血液筛查方式并未得到推广应用。2次ELISA筛查仍然存在漏检、误检风险，存在输血残余风险，面对该问题[7]，应该强化ELISA与NAT的联合应用研究，为提升献血者血液筛查准确性奠定基础。

本次研究结果显示ELISA检测阳性率为1.07%，而NAT技术检测结阳性率为0.48%。在2次ELISA检测基础上进行NAT检测，发现ELISA检测存在漏诊、误诊，其中17例为误诊，2例为漏诊。由此判断在献血者血液筛查中应用2次ELISA检测也存在漏诊、误诊风险，仍有输血残余风险，可能经输血传播乙肝、丙肝、艾滋病[8]。因此，有必要进一步提升献血者血液筛查准确性、降低输血残余风险。ELISA检测以血液标本中的抗体和抗原为对象进行血液分析，无需对血液标本进行处理，以抗原-抗体反应识别判定结果。但是抗原、抗体形成时间较长，该时期被称为病毒窗口期，窗口期病毒不能通过抗原、抗体检测出[9]。因此ELISA检测存在明显不足，据统计窗口期病毒是导致ELISA检测当中HBV、HIV漏诊的主要原因。本次研究中2例研究对象的血液标本ELISA检测阴性，NAT技术检测阳性，最终经随访追踪检查证实HbsAg阳性，为窗口期HBV感染，也证实ELISA检测会漏诊窗口期病毒感染[10]。NAT技术[11]是将血液中的病原体核酸作为检测对象，能够缩短窗口期，可以在病毒侵入人体早期发现病毒，能够弥补ELISA法在窗口期病毒感染中筛查中的不足。而窗口期的病毒载量很高，具有极强的传染性，NAT技术准确检测出窗口期的病毒感染能够提升用血安全性、降低输血残余风险[12]。本次研究中在2次ELISA检测后进行NAT技术检测，发现17例为误诊、2例为漏诊，进一步提升了血液筛查质量，降低了输血残余风险，提升了用血安全性。但NAT技术也存在自身不足，其操作步骤繁琐，耗时长、容易造成污染，尽管近年来二氧化硅、玻璃粉、硅藻及自动化设备的应用都极大的提升了核酸的提取速率，简化了检测步骤，但所需时间仍然较长[13]。

上述研究分析可知ELISA法、NAT技术在献血者血液筛查当中均具有自身优势和不足，两者具有互补性，应联合应用。其互补性具体体现如下：①病理生理过程互补：ELISA法检测具有较长的“窗口期”，容易发生漏诊，而NAT技术检测窗口期病毒的时间较短，且因为机体的保护性抗体还没有产生，病毒载量很高，具有高传染性，NAT技术检测能够通过减小窗口期提升用血安全性[14]。②受治疗药物影响不同：NAT技术检测对于治疗后转阴的献血者血液标本不敏感，如在应用拉米夫定、干扰素治疗后一些患者的NAT技术检测结果转阴，而ELISA法检测仍为阳性，尽管此种现象少见，但也证实两种检测方法具有互补性。

需要指出的是本次研究中NAT技术仅检测出2例ELISA检查HBV漏诊者，但未发现HCV、HIV漏诊者，这可能与本次研究中HCV、HIV感染样本量少有关，不能说明HCV、HIV无窗口期，也不能说明ELISA检查对于HCV、HIV无漏诊。对此今后仍需针对HBV、HCV、HIV展开分别研究分析。

本次研究证实对献血者血液进行2次ELISA筛查仍然存在漏检风险，联合应用NAT技术能够提升献血者血液筛查准确性，降低输血残余风险，保证用血安全。但是NAT技术并不能完全消除HBV、HCV、HIV的输血感染风险，因此不能取代ELISA单独应用。临床当中应联合应用ELISA、NAT技术，建立科学的血液病毒筛查系统，最大限度降低输血残余风险，保证用血安全。