HDAC2与乙酰化P53k320在胃癌细胞中的表达及对其疗效的评价

(临沂市中心医院，山东 沂水 276400)

研究证实，肿瘤的发生和发展是多个信号通路和多基因共同参与的结果[1]。其中，细胞组蛋白乙酰化受到组蛋白去乙酰化酶(HDACs)和组蛋白乙酰化转移酶的共同调控，当HDACs呈现为病理活性和异常表达后会引发机体免疫紊乱、肌营养不良以及癌症的发生。有研究表明[2]，HDAC2的目标蛋白为抑癌基因P53，其过度表达与恶性肿瘤发生相关，其表达的高低可作为临床上独立的预后指标，也可作为组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACi)疗效的标志。本研究分析HDAC2、乙酰化P53k320在胃癌组织和癌旁组织细胞中的表达，探讨其对疗效的评价作用。

1 资料与方法

1.1临床资料 选取2018年1月—2019年1月本院收治的胃癌患者130例，其中男86例，女44例；年龄35～75岁，平均(55.5±2.6)岁；肿瘤直径：>5 cm者29例，≤5 cm者101例；Lauren分型：弥漫型35例，肠型82例，混合型13例；分化程度：高分化67例，中分化34例，低分化29例；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期68例，Ⅲ～Ⅳ期62例；淋巴结转移：有59例，无71例。所有患者或家属均签署了知情同意书。所有患者经临床治疗后，完全缓解(CR)65例，部分缓解(PR)26例，稳定(SD)19例，进展(PD)20例。

1.2方法

1.2.1组织采集 取所有患者手术切除的癌组织和癌旁组织，其中50%组织在10%中性甲醛中固定，24 h后行常规石蜡包埋，制作组织切片，厚度为4 μm，用于后续免疫组化染色。另外50%组织作后续细胞分离。

1.2.2免疫组化 将所制备的癌组织和癌旁组织石蜡切片在二甲苯中重复脱蜡10 min，行梯度酒精水化，将蛋白酶修复液加入37℃的恒温冰箱中行孵化处理30 min，去除抗原修复液，将所制备的切片转移至内含3% H2O2的湿盒中，密封(去过氧化物酶封闭液)，在37℃的恒温冰箱中行孵化处理10 min，使用PBS清洗。清洗完成后将山羊血清加入，在室温下封闭处理30 min，将封闭液吸除(滤纸)，加入一抗，放入至适合后加入二抗，在室温下孵育处理1 h，运用PBS清洗，行DAB显色10 min，采用梯度乙醇进行脱水，采用二甲苯冲洗片3次直到透明，采用中性树脂封片处理，显微镜下观察免疫组化染色情况。每份标本在镜头下随机选择5个视野，所有病理切片均由2位以上经验丰富的医师采用双盲法进行诊断。根据染色程度和染色细胞百分比进行评分：不着色0分，淡黄色1分，黄色2分，棕黄色3分；着色细胞数≤5% 0分，6%～25% 1分，26%～50% 2分，≥51% 3分。阴性(-)得分≤1分，弱阳性(+)得2～3分；中度阳性(++)得4～5分；强阳性(+++)得分≥6分。

1.2.3细胞分离 取备用的癌组织和癌旁组织，去除结缔组织后洗净剪碎，使用0.1%的胰酶、0.025%的Ⅰ型胶原酶在37℃环境下消化30 min，使用滤网滤渣，在4℃环境下500×g离心5 min，弃去上清液；在DMEM-E培养基(5 ml，内含20%人血浆)中孵育5 min，细胞重悬后将20%的Percoll细胞分离液在4℃环境下500×g离心15 min，收集含有细胞的沉淀，经DMEM-E反复洗涤2次，每次均在4℃环境下500×g离心5 min，将所获得的细胞转移至培养瓶中，使用10% FBS、牛脑抽提物(100 g/ml)、谷氨酰胺(2 mmol/L)、青霉素(100 U/ml)、链霉素(100 mg/ml)的DMEM-E培养基中培养48 h，弃去上清液，将未贴壁的细胞洗掉后继续培养，在培养1周后挑选多个形成的集落，混合均匀，转移至新培养瓶中培养。

1.2.4癌细胞中HDAC2 mRNA检测 采用荧光定量RT-PCR检测，取对数生长期的胃癌细胞、癌旁细胞按照制备试剂盒说明书提取胎盘组织中总RNA，之后对RNA纯度、含量进行检测，使用Takara逆转录试剂盒行逆转录处理后获得cDNA，之后使用Primer5.0软件对引物序列进行设计，使用RT-PCR方法检测胃癌细胞中HDAC2 mRNA表达量，采用2-△△Ct方法计算出需要检测的表达量。HDAC2引物序列：上游：5’-TGACATTGTGCTTGCTGTCC-3’，下游：5’-CCCTCAAGTCTCCTGTTCCA-3’；内参基因GAPDH引物序列：上游：5’-AACAGCCTCAAGATCATCAGCAA-3’，下游：5’-GACTGTGGTCATGAGTCCTTCCA-3’。

1.2.5癌细胞中HDAC2及乙酰化P53k320蛋白表达的检测 取对数生长期的胃癌细胞、癌旁细胞，将培养液去除，反复使用PBS冲洗2遍，0.25%胰蛋白酶消化处理后离心，再次使用PBS反复冲洗2遍，将细胞收集至1.5 mL的离心管中，将200μL预冷的RIPA细胞裂解液在冰上采用超声仪对细胞进行超声裂解，2 s/次，共5次，在4℃环境下500×g离心5 min，将上清液转移至新离心管中，蛋白定量分装采用Bradford方法，采用Western blot法检测胃癌细胞、癌旁细胞中HDAC2蛋白及乙酰化P53k320蛋白表达量。

2 结果

2.1HDAC2及乙酰化P53k320中阳性细胞的表达胃癌组织HDAC2阳性表达率高于癌旁组织，乙酰化P53k320阳性率低于癌旁组织。见表1、封二图1。

2.2HDAC2 mRNA HDAC2蛋白及乙酰化P53k320蛋白的表达 胃癌细胞中HDAC2 mRNA、HDAC2蛋白表达量均高于癌旁细胞，乙酰化P53k320蛋白表达量低于癌旁细胞。如表2、封二图2。

表1 两种组织HDAC2及乙酰化P53k320中阳性表达情况比较[n(%)]

表2 两种细胞中HDAC2 mRNA、HDAC2蛋白及乙酰化P53k320蛋白表达情况

2.3HDAC2及乙酰化P53k320对疗效的评价作用 CR、PR、SD、PD组患者癌组织中HDAC2蛋白表达量呈增高趋势，乙酰化P53k320蛋白表达量呈降低趋势；两两比较显示，各组之间均有统计学意义(q=5.75～54.76，P<0.05)。见表3、封二图3。

表3 HDAC2及乙酰化P53k320蛋白表达与疗效的关系

3 讨论

目前发现抑癌基因P53与人类肿瘤发生关系最为密切。临床推测，胃癌的发生和进展可能与野生型P53功能受到抑制有关[3]，这种抑制可能与表观遗传学组蛋白去乙酰化酶相关[4]。组蛋白乙酰基转移酶具有催化乙酰基的作用，使其转移至组蛋白乙酰基转移酶；而HDACs作用与其相反，可逆转赖氨酸残基乙酰化。可逆的乙酰化会调控非组蛋白，包括P53、NF-κB、STATs等。因此，乙酰化的依赖通路与其他转录后修饰具有一定的相关性，可维持机体动态平衡。正常P53需部分乙酰化，HDAC2是通过去乙酰化调控P53。

k320是位于P53DNA连接域/四聚化结构域，P53信号通路与k320乙酰化相关。Brandl等[5]研究显示，结肠癌细胞中HDAC2和P53之间的作用可抑制P53k320乙酰化，进而影响靶基因的转录调控。目前，随着对HDAC2的研究深入，发现其在多数恶性肿瘤中均呈现高表达，包括卵巢癌、胰腺癌、肾癌、肾癌、肝癌等。Masoud等[6]研究发现HDAC抑制因子或者RNA抑制剂均会抑制肾癌细胞中HDAC2的高表达。在乳腺癌的研究中表明，抑制HDAC2表达会增强P53靶基因Bax的表达，细胞增殖加速[7-8]。有学者通过分析HDAC2与P53k320乙酰化之间的相关性[9-10]，认为当P53k320乙酰化降低后会增加P53靶基因的表达，且HDAC2会逆转P53k320乙酰化，促进细胞增殖。本研究结果显示，胃癌细胞中HDAC2高表达，乙酰化P53k320低表达，表明在胃癌发生过程中，HDAC2表达升高可能抑制P53k320乙酰化。此外，本研究结果还显示，患者治疗效果越好者其HDAC2蛋白表达量越低，乙酰化P53k320蛋白表达量越高，这可能与胃癌患者治疗后，HDAC2的高表达受抑制，P53k320乙酰化增加，最终促进癌细胞凋亡相关。提示，HDAC2、乙酰化P53k320可作为评估胃癌患者治疗效果的指标。