生物表面活性剂槐糖脂研究概况

蔡京荣 吕佳佳

（阳煤丰喜泉稷能源有限公司，山西稷山，043200）

槐糖脂（sophorolipid）是一种具有可生物降解、毒性低、环境相容性好等特点的生物表面活性剂[1]。它首次发现于1954年，是由Torulopsis sp产生的[2]。除了有较好的乳化、分散、增溶等表面特性外，槐糖脂还具有抑菌、抗病毒、抗肿瘤、抗炎等生物活性[3-4]。目前已在食品、医药、日化、冶金、环保、废油回收等领域获得应用。

国际上对槐糖脂的有关理论和应用的研究已开展多年，国内虽然进行了有关研究，但整体上仍处于起步阶段。本文从化学结构、理化性质、生产方法、分离和纯化、主要应用、研究现状等方面对槐糖脂的研究概况进行综述，以期为相关研究提供借鉴。

1 槐糖脂的结构和性质

1.1 化学结构

由微生物代谢产生的槐糖脂一般是由一系列槐糖脂分子组成的混合物，这些槐糖脂分子均包含亲水基和疏水基，亲水基是由两分子葡萄糖以β-1,2糖苷键结合而成的槐糖，疏水基为饱和或不饱和长链ω-（或ω-1）羟基脂肪酸，亲水基和疏水基以β-糖苷键连接，这些槐糖脂依其是否存在内酯化，可分为内酯型和酸型[5]。

1.2 槐糖脂的性质

1.2.1 理化性质

槐糖脂临界胶束浓度为11～250 mg/L，表面活性较强，可将水的表面张力从72.8 mN/m降至30-40 mN/m。当pH≤5.0时呈胶态分布；当pH 5.6～5.8时溶解度最高；当pH≈6.0时，可完全溶解于水；当pH≥7.0时，乙酰基和酯键发生不可逆水解。一般来说，内酯型槐糖脂的亲脂性较高，具有降低液体表面张力的能力，酸型槐糖脂的水溶性较好，发泡能力较强[6]。

图1 内酯型槐糖脂结构式

研究表明：槐糖脂脂肪酸碳链的长度越长，其表面活性和生物可降解性越高，CMC值越小。Zhang等[7]将一系列槐糖脂烷基酯的表面活性和降解性进行了对比，结果表明：槐糖脂烷基酯脂肪酸碳链每增加一个-CH2，其CMC值降低50%，而生物可降解性随之增加。随后，Shin等[8]发现槐糖脂脂肪酸碳链为油酸（C18）的槐糖脂甲酯比脂肪酸碳链为芥酸（C22）的槐糖脂甲酯更难降解。

1.2.2 生物活性

槐糖脂具有抗肿瘤、抗细菌、抗真菌、抗病毒和抗炎等生物活性。

胡静等[9]分别以豆油和葡萄糖为底物，发酵制得槐糖脂，研究了槐糖脂对人宫颈癌细胞的抑制作用，发现不同底物发酵制得的槐糖脂对人宫颈癌细胞均有抑制作用，且细胞存活率随槐糖脂浓度的增加均呈现降低趋势，以葡萄糖为底物制备的槐糖脂质量浓度达到200 μg/mL时的体外抑瘤率可达87.4%，以豆油为底物的槐糖脂浓度达到500 μg/mL时的体外抑瘤率为71.1%。

图2 酸型槐糖脂结构式

Kim等[10]发现内酯型槐糖脂对部分引起泌尿系统感染、胃肠道感染的革兰氏阴性菌及引起新生儿脑膜炎的链球菌，均表现出优良的抑制作用，当其浓度达到30 μg/mL时，对致病性革兰氏阴性菌的致死率可达到100%。

袁兵兵等[11]对槐糖脂的抑真菌性能进行了研究，发现了槐糖脂对水果有保鲜作用，经过槐糖脂涂抹的水果失重率明显降低，且表皮可保持光泽不起褶皱，从而，有望开发一款新型果蔬保鲜杀菌剂。

Bluth等[12]发现槐糖脂可通过抑制动物体内败血症病毒的增殖，减少生物败血症病毒性休克，降低动物死亡率。

Napolitano等[13]对患有败血症的小鼠，通过静脉注射槐糖脂，明显提高了小鼠存活率。他认为是槐糖脂加速了巨噬细胞的衰减，抑制了炎症的发展与扩散。

2 槐糖脂的生产、分离提纯方法

2.1 槐糖脂的主要生产菌种

目前槐糖脂主要采用微生物发酵法生产，科学家们于20世纪60-70年代，经过筛选、鉴定，得到Torulopsis magnolia（现称为Candida apicola）、Torulopsis gropengiesseri、Trulopsis bobmbicola及Candidabogoriensis等槐糖脂产生菌[14]。近几十年，有关研究者又逐步筛选出Wickerhamiella domercqiae、Pichia anomala、Candida batistae、Candida riodocensis、Candida stellata和Candida sp.Y-27208等新的产生菌[15]。

槐糖脂的产生菌主要为各种非致病性酵母菌，除Rhodotorula bogoriensis为担子菌外，多为子囊菌，其不同物种的亲缘关系见图3。其中Candida bombicola的应用最广泛。

2.2 槐糖脂的生物合成途径

图3 槐糖脂产生菌和非槐糖脂产生菌的系统树

在槐糖脂的微生物合成过程中，涉及的关键酶主要有细胞色素P450[16]、两种葡萄糖基转移酶[17]、乙酰基转移酶[18]、内酯化酶[19]和一种输送酶[20]。

根据碳源的不同，槐糖脂的生物合成途径也不同，但均需要活化后的葡萄糖和一种普通的脂肪酸。

2.2.1 以葡萄糖和脂肪酸为复合碳源

部分葡萄糖经糖酵解，分解为丙酮酸，然后在丙酮酸脱羧酶的作用下生成乙酰CoA，乙酰CoA进入三羧酸循环，为菌体提供生长代谢能量。脂肪酸在单加氧酶细胞色素P450的作用下生成ω-/ω-l羟基脂肪酸，在葡萄糖基转移酶I的作用下，将一个葡萄糖分子转移到ω-/ω-l羟基脂肪酸，生成葡萄糖脂；在萄糖基转移酶II的作用下将另一个葡糖分子转移到葡萄糖上，生成槐糖脂；在乙酰转移酶和内酯化酶的作用下生成乙酰化的内酯型槐糖脂[21]。

2.2.2 以烃类物质或脂肪酸为唯一碳源

图4 以葡萄糖和脂肪酸为复合碳源时槐糖脂的合成途径

在脂肪酸脱氢酶或脂肪醇氧化酶的作用下，烃类物质变成脂肪酸，部分脂肪酸经氧化生成乙酰CoA，进入三羧酸循环，为细胞生长和代谢提供能量；三羧酸循环过程中产生的中间产物通过糖异生途径生成葡萄糖。部分脂肪酸在单加氧酶细胞色素Cyt P450的作用下生成ω-/ω-1羟基脂肪酸，由葡萄糖基转移酶I催化，将一个葡萄糖分子转移到ω-/ω-1羟基脂肪酸，生成葡萄糖脂；在葡萄糖基转移酶II的作用下将另一个葡萄糖分子转移到葡萄糖脂上生成槐糖脂；最后由乙酰基转移酶和内酯化酶催化，生成乙酰化的酸型/内酯型槐糖脂[22]。

2.2.3 以葡萄糖为唯一碳源

葡萄糖经EMP途径分解为丙酮酸，其中一部分通过糖异生途径生成新的葡萄糖分子；另一部分在丙酮酸脱羧酶的作用下，生成乙酰CoA，部分乙酰CoA进入TCA循环，为菌体的生长代谢提供能量，部分通过从头合成途径合成脂肪酸。新合成的脂肪酸在单加氧酶细胞色素Cyt P450的作用下生成ω-/ω-1羟基脂肪酸，由葡萄糖基转移酶I催化，将一个葡萄糖分子转移到ω-/ω-1羟基脂肪酸，生成葡萄糖脂；在葡萄糖基转移酶II的作用下将另一个葡萄糖分子转移到葡萄糖脂上生成槐糖脂；最后由乙酰转移酶或内酯化酶催化，生成乙酰化的酸型或内酯型槐糖脂[23]。

2.4 槐糖脂的分离纯化

依据最终产物纯度的差异，可以把槐糖脂纯化过程分为粗提、中度纯化和精细纯化三个阶段。常用的纯化方法有凝胶过滤层析和薄层层析[24]。

图5 以烃类物质或脂肪酸为唯一碳源时槐糖脂的合成途径

硅胶柱层析法是根据硅胶对被分离物质的吸附力的不同而得到分离纯化，吸附力的强弱是由被分离物质极性大小而定。一般情况下，极性较弱的物质不易被硅胶吸附，极性较大的物质易被硅胶吸附。被分离物质的整个层析过程包括：吸附、解吸、再吸附、再解吸的过程。

凝胶过滤层析法又名排阻层析或者分子筛方法，依据蛋白质的大小和形状，通过在层析柱中填充某些惰性的多孔网状结构物质进行分离，从而对蛋白质的质量进行分离和纯化。

硅胶层析法是依据硅胶和各种不同物质之间吸附力的不同而能够将不同物质分离开来。

薄层层析又名薄层色谱，属于色谱法的一个种类，通过固-液吸附色谱从而快速分离和定性分析少量物质的一种重要的实验技术，同时具备了柱色谱和纸色谱的优点。

3 槐糖脂的主要应用

3.1 食品工业

槐糖脂不仅具有乳化、增稠、润滑等特性，而且无臭、无味、无毒、对人体无害，因此，可以作为食品添加剂用来改善食品的口味和品质。此外，还有报道在冷藏运输过程中，用于防止形成冰粒子。

3.2 石油工业

Beckman1926年首先提出的用微生物提高原油采收率的设想，被称为最有发展前景的一项采油技术。生物表面活性剂可以很容易地溶解在地层水和注入水中，在油-水界面上发挥其较高的表面活性。研究表明：生物表面活性剂的驱油效率比人工合成的表面活性剂的驱油效率高3.5～8倍[25]。

德国学者将酵母菌生产的槐糖脂发酵液用于室内驱油实验，发现它具有较强的驱油能力，不加助表面活性剂时石油采收率便能达到87%。国内学者筛选出的一种耐盐3%～5%、耐温40～80℃的糖脂类表面活性剂，在与多糖、槐糖脂或鼠李糖脂复配时呈现“超加和”现象，能获得低界面张力[26]。

3.3 环境保护

槐糖脂已被应用于环境保护中的多个方面，例如：石油污染的生物修复、从焦油中分离沥青[27]、土壤中重金属离子的去除[28]、水中金属离子和烃类的去除[29]、有害藻类危害的减轻[30]等。

3.4 医药领域

很多报道均证明槐糖脂具有很好的抗菌活性、抗炎症活性、抗肿瘤活性、抗病毒活性和杀精子活性等。这些在医药领域的应用，提高了槐糖脂的经济附加值，使槐糖脂具有良好的应用前景。但槐糖脂的分子结构与槐糖脂药学活性的关系目前还不清楚[31]。

3.5 日化领域

法国Soliance公司推出的化妆品Sopholiance S，主要成分为槐糖脂，具有较温和的杀菌功效，可以高效抑制痤疮丙酸杆菌及乳酸棒杆菌，同时可以抑制脂肪酶的活性，防止皮脂分解而产生游离脂肪酸。另外，据很多专利报道，槐糖脂还能刺激人真皮层纤维细胞的生长和胶原蛋白的重新合成，减少皮下脂肪储存，因此，可以添加到抗衰老化妆品中[32]。

另外，槐糖脂在纳米技术[33]、昂贵材料[34]方面也有相关应用报道。

4. 槐糖脂目前研究的重点

虽然槐糖脂具有诸多优点，特别是在环境污染生物治理方面具有极其重要的作用，但其成本居高不下，限制了其广泛应用。目前有关研究主要是围绕如何优化发酵条件和提高提取纯化工艺手段、如何获取廉价的发酵生产材料、如何运用生物技术手段（基因改造、基因重组、基因突变等）选育出高产菌株，以提高产量和降低成本而展开。

脂肪酸的羟基化是球拟酵母在合成槐糖脂过程中的关键步骤，该步骤耗氧较大，因此，在较高密度情况下发酵，溶解氧水平往往是制约菌体细胞生长和合成槐糖脂的重要因素[35]。通过调整发酵工艺可以有效提高菌体细胞外源的溶氧供给水平，如增加通气量、加快搅拌速度、提高罐压、提高发酵罐的径高比等传统措施，但这些对设备强度等要求较高，且二氧化碳分压过高还会限制细胞的生长；另外，添加补料技术也是提高溶氧供给水平的重要工艺手段，且该技术对设备没有特殊要求。

目前，见诸报道的可用于槐糖脂发酵生产的廉价底物有还原糖类、脂肪酸类、烃类、工业副产品及木质纤维素类等。Zhou等[36]以100g/L葡萄糖、10.5% 菜籽油（体积分数）和4g/L酵母粉为培养基，发酵8天，转化率达到80%，槐糖脂的产量达到90～110g/L。Casas等[37]以葡萄糖和不同植物油为复合底物间歇培养C. bombicola，疏水性底物为葵花油时槐糖脂产量最高，达到11.0g/L，其次分别是橄榄油、玉米油、葡萄籽油和椰子油。Davila等[38]分别以C12、C14、C16、C18烷烃为单一碳源时，发现随着碳原子数的增加、碳链的增长，则更有利于槐糖脂的合成，产量分别为 17.0、20.0、95.0和175.0 g/L，且C16和C18合成槐糖脂的效率更高。Kim等[39]提出以100 g/L葡萄糖和100 g/L大豆黑油为共底物，对C. bombicola进行流加培养，7天后得到90.0 g/L的槐糖脂。Konishi等[40]改进了玉米芯合成槐糖脂的工艺，降低了酸用量，获得了43.8 g/L的产量。

通过基因重组手段，在槐糖脂生产菌株中导入氧的传输和利用基因以提高胞内氧气利用率，是槐糖脂生产菌株基因重组的关键环节。透明颤菌血红蛋白（VHb）在表面活性剂产生菌Gordonia amarae和铜绿假单胞菌重组菌株PaJC及毕赤酵母中的异源表达可明显促进菌株对氧的利用率。

5 结束语

作为一种最具有发展前景的生物表面活性剂，槐糖脂虽然在日化、环境、食品、医药方面都有应用价值，但大都处于实验阶段，目前制约槐糖脂广泛应用的主要瓶颈是其昂贵的价格，所以，今后有关研究的重点，将紧紧围绕如何降低槐糖脂的成本而展开。其一是在生产菌株改造方面，通过诱变和基因改造，筛选出产量更高、遗传性更稳定的高产菌株；其二是对发酵生产工艺进行更深层次的优化，尤其是分离纯化阶段的研究，开发出适合规模化生产的发酵工艺；其三是拓宽廉价原材料的范围，进一步降低槐糖脂的生产成本；最后是对槐糖脂的结构、活性及其构效关系进行更深入的研究，为槐糖脂的开发应用创造更广阔的前景。