脆弱拟杆菌在炎症性肠病、结直肠癌 促进、调控及防治中的作用

吕志堂， 许晓娜， 张怡君

(河北大学生命科学学院 生命科学与绿色发展研究院 河北省微生物多样性研究与应用实验室，河北 保定 071002)

炎症性肠病(inflammatory bowel disease, IBD)是慢性复发性炎症，分为两种主要的临床表型：溃疡性结肠炎(ulcerative colitis, UC)和克罗恩病(Crohn′s disease, CD)，病因尚不明确。CD或UC患者随疾病延长，胃肠道和肠道外恶性肿瘤的风险均显著增加，尤其结直肠癌(colorectal cancer，CRC)是与IBD最相关的癌症[1]。近年来，CRC发病率一直呈上升趋势，在全球恶性肿瘤发病率中已上升至第三位(10.2%)，其死亡率居恶性肿瘤死因的第二位(9.2%)。在我国，CRC死亡率已位于恶性肿瘤死亡率的第五位，严重危害人类健康[2]。值得关注的是，在老年群体中，CRC的发病率有下降趋势。而与之相反的是，年轻人CRC的发病率已接近20世纪90年代的2倍。CRC已成为全世界范围内严重的健康问题，因为它是与癌症相关的死亡率最高的疾病之一[3-4]。尽管已经做出了各种努力，但是由于其复杂性，CRC的发展仍有待完全了解。长期以来，人们普遍认为饮食(高红肉/低纤维)、肥胖、吸烟、饮酒和遗传是CRC发生和发展的最重要的危险因素[5]。最近的研究表明，CRC的发生、发展和肠道菌群之间有着显著的联系。CRC的饮食风险可能与肠道菌群失调及其代谢产物的代谢异常有关。越来越多的研究证明，肠道中的微生物菌群失调可能是CRC发生和发展的一个重要病因[6]。科学家陆续发现，大肠埃希菌(Escherichiacoli)、脆弱拟杆菌(Bacteroidesfragilis)、具核梭杆菌(Fusobacteriumnucleatum)和厌氧消化链球菌(Peptostreptococcusanaerobius)等都与CRC有关，它们通过释放基因毒素、调节肿瘤微环境或是刺激免疫细胞的免疫应答等途径参与CRC的发生与调控[7-9]。此外，研究表明，在几种结肠炎和CRC动物模型中，对某些细菌的治疗可缓解癌细胞系中的炎症反应，并且口服长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)、多发酵芽胞杆菌(Bacilluspolyfermenticus) 、干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)等有益细菌可防止结肠发病[10-12]。这些研究的结果表明，调节菌群可能是预防或治愈CRC的好策略。其中，脆弱拟杆菌极具代表性，不同类型的脆弱拟杆菌菌株在CRC发生、调控和防治中具有截然相反的作用。

1 脆弱拟杆菌的两种类型与三种模式

拟杆菌属(Bacteroides)的脆弱拟杆菌(Bacteroidesfragilis，BF)是拟杆菌门最常见的成员之一，这种共生革兰阴性厌氧菌常见于健康人类肠道菌群，但也在口腔、上呼吸道和女性生殖道中发现，同时也是从腹泻、腹膜炎、腹内脓肿、败血症、炎症性肠炎、肠道癌症等的临床病例中分离的最常见的肠道微生物[13]。

脆弱拟杆菌菌株可分为两类:不含或不分泌脆弱拟杆菌毒素的非产肠毒素脆弱拟杆菌(nontoxigenicBacteroidesfragilis，NTBF)菌株；在其致病性岛(pathogenicity island,PAI)中含有编码脆弱拟杆菌毒素(Bacteroidesfragilistoxin，BFT)bft基因的产肠毒素脆弱拟杆菌(enterotoxigenicBacteroidesfragilis，ETBF)菌株[5]。ETBF属于致病性菌株，研究表明定殖于肠道的ETBF与能量代谢障碍、肠道疾病以及其他疾病发生密切相关，如菌血病、炎症性肠病、腹泻、结肠直肠癌、肠易激综合征等肠源性疾病等。但ETBF导致肠源性疾病的发病机制尚不完全清楚，其在肠源性疾病中的作用还有待深入研究。相比之下，NTBF菌株通常被认为是有益的共生菌，可能通过种间竞争来对抗ETBF[14]。这些有益菌株通过释放某些有利分子来促进肠道健康，其中一种已被明确鉴定为多糖A(polysaccharide A, PSA)[15]。然而，NTBF如何将这些效应分子传递给宿主细胞尚不清楚。

ETBF的bft基因位于致病岛(PAI)上。 PAI从侧翼区域进入细菌的染色体(接合型转座子CTn86)。NTBF菌株不具有PAI，但是某些菌株侧翼区域的存在使PAI从ETBF传递到NTBF菌株[16-17]。基于此假设，可以将BF分为三种模式(pattern)。将具有bft基因的ETBF定义为模式I，将非毒素NTBF定义为模式II和III，其中，模式II定义为无PAI区域和侧翼区域的菌株，模式III定义为无致病岛区域但具有侧翼区域的菌株[18]。

2 脆弱拟杆菌与炎症性肠病、结直肠癌

2.1 炎症性肠病、结直肠癌与肠道菌群

CRC发生的主要触发因素通常是菌群紊乱导致的肠道中的慢性炎症，例如IBD[19-20]。大约一半的IBD患者会发展为CRC[21]，但慢性IBD如何导致CRC发生的机制尚不完全清楚。

尽管尚未完全了解其病因和发病机制，但与IBD相关的遗传多态性表明，针对肠道菌群失衡的异常免疫反应是疾病发病机制的关键机制[22-23]。国外大量研究表明，IBD患者肠道菌群生物多样性降低，厚壁菌门(Firmicutes)几个分类单元的丰度降低以及γ-变形杆菌纲(γ-Proteobacteria)的丰度增加[23-27]。Sha等[28]对确诊的IBD患者肠道优势菌群进行DGGE检测发现：与健康对照者相比，BF在活动期UC 和CD 患者粪便中丰度均偏低。南方医科大学陈烨和周宏伟团队通过将一系列中国IBD患者的粪便微生物群与两个西方IBD人群(PRISM和RISK)结合起来进行荟萃分析，发现IBD中肠道微生物的变化模式在中国人和西方人中相似。放线菌门(Actinobacteria)和变形菌门(肠杆菌科Enterobacteriaceae)丰度的相对增加以及厚壁菌门(梭菌目Clostridiales)丰度的相对降低与IBD严重程度密切相关(P<0.05)。他们基于肠道菌群开发出一套预测模型用于IBD诊断，克罗恩病及溃疡性结肠炎的预测准确率分别为87.5%及79.1%[29]。

ETBF在儿童和成人中引起急性炎症性腹泻病、CRC等，但也无症状地定殖在20%至35%成人肠道中[18]。早期采用分离培养技术发现CRC 患者粪便中BF 的检出率高于正常人群，提示BF 可能在CRC的形成过程中发挥作用。多项研究证明，与没有结肠癌的对照组相比，患有结肠癌的个体有更高的ETBF定殖率[30-31]。CRC患者肠道菌群中3种BF模式菌株丰度为模式I>模式III>模式II，而健康人群肠道菌群中3种BF模式菌株丰度为模式II>模式III>模式I[32]。

ETBF是最常见的致癌细菌，也是CRC发生的主要环境因素之一，这一观点已经逐渐被广泛接受[34-35]。

2.2 ETBF促进炎症性肠病发生进而促进CRC发生

2.2.1 ETBF在IBD和CRC患者肠道富集 Sears等[18]首次将ETBF定义为人类的炎症性肠道病原体。ETBF的bft基因编码的脆弱拟杆菌毒素BFT为一种20 kD的分泌蛋白，该毒素是一种锌依赖性金属蛋白酶，具有3个同种型BFT-1、BFT-2和BFT-3，可导致脱氧核糖核酸损伤[35-36]。

Prindiville等[37]最早发现了与无炎症性肠病的对照患者相比，bft基因在IBD患者中明显更常见，这提高了ETBF可能引发IBD发作或复发的可能性。解玲玲等[38]通过荧光定量PCR分析发现，直肠腺瘤患者结肠黏膜中细菌总数明显少于健康人群，但ETBF含量明显高于健康人群。

小鼠实验表明，尽管ETBF和 NTBF都长期定居在小鼠中，但只有ETBF会触发结肠炎，并在多发性肠肿瘤(Min)小鼠中强烈诱导结肠肿瘤。Rhee等发现野生型ETBF在SPF小鼠中诱导急性结肠炎，然后诱导持续性结肠炎，在野生型无菌小鼠中诱导快速致死性结肠炎[39]。因此假设定殖于人体的ETBF可以在人类中诱发持续的结肠炎，并诱导CRC发生。

Hajishengallis等[39]关于ETBF与管状腺瘤、锯齿状息肉和低度发育不良的重要关联的关键发现支持ETBF在导致结直肠癌的遗传中起着关键作用，与正常健康人群相比，CRC人群肠道中ETBF编码的bft基因表达显著增加[40-41]。

2.2.2 ETBF通过其分泌的BFT降解E-钙粘蛋白促炎致癌 ETBF促炎、致癌的根本原因在于其编码的毒素BFT。BFT在宿主结肠上皮细胞中诱导E-钙粘蛋白的严重降解，导致多种炎症细胞的渗透和黏膜上皮细胞层的破坏，影响肠上皮细胞通透性，破坏屏障功能并激活NF-κB信号通路诱导促炎基因表达[40,42-44]。例如E-钙粘蛋白的胞质结构域与核信号蛋白β-连环蛋白相关，E-钙粘蛋白的丢失触发β-连环蛋白核信号，胞质溶胶中游离β-连环蛋白的积累可诱导癌基因c-myc表达和白细胞介素-8 (IL-8)产生[30,40]。β-连环蛋白在细胞内的稳定性是至关重要的，并且由某些肿瘤抑制因子维持，例如腺瘤息肉病大肠埃希菌蛋白(APC)[45]。APC的肿瘤抑制功能在于其适当调节细胞内β-连环蛋白水平的能力。相比之下，游离β-连环蛋白在转移到细胞核中并与T细胞因子/淋巴增强因子家族成员复合后，作为激活这些转录激活因子的信号分子发挥作用。这导致包括c-myc在内的Tcf(T细胞因子)靶基因表达增加[30]。apc基因或编码β-连环蛋白(提供对与APC蛋白结合的抵抗)的基因中的突变诱导细胞质中游离β-连环蛋白的积累，这导致细胞核中癌基因的转录增加[45]。细胞质中的另一个β-连环蛋白与E-钙粘蛋白的胞内结构域相连。E-钙粘蛋白也可以被认为是一种肿瘤抑制因子，因为它稳定了细胞内β-连环蛋白的第二个库[30]。Boleij等发现，体外BFT结合至特定结肠上皮受体激活Wnt和NF-κB信号通路，从而促进细胞增殖、促炎性介质上皮释放并诱导DNA损伤；在多发性肠肿瘤(MinApc +/-)小鼠和患有CRC人类中，ETBF促进IL-17依赖性致癌作用[46]。癌症进展是一个复杂的过程，涉及到通过肿瘤微环境的多种分子和细胞因素的宿主肿瘤相互作用。可见BFT是一种致癌细菌毒素，通过降解肿瘤抑制E-钙粘蛋白，触发β-连环蛋白核信号和结肠上皮细胞增殖，通过调节黏膜免疫反应和诱导上皮细胞变化在CRC的发生和发展中发挥作用[47]。

2.2.3 ETBF通过上调ICAM-1基因导致IBD 炎症细胞的初始募集和激活对于ETBF感染部位的细菌发病机制很重要[8]。Roh等[48]研究了ICAM-1对BFT刺激的诱导反应，发现暴露于BFT的内皮细胞通过激活一个信号通路导致ICAM-1的上调，该信号通路包括AR、JNK、 MAPK、IκB激酶(IKK)和NF-κB，最终导致单核细胞黏附于内皮细胞。证明了内皮细胞暴露于BFT导致MAPK信号的快速激活。激活的MAPK通过IKK和NF-κB信号传导介导ICAM-1基因的表达。此外，信号传导受AR活性调节，最终BFT会导致IBD的发生。

2.2.4 ETBF通过Stat3/Th17依赖性促炎致癌 人肠道共生细菌ETBF可通过Stat3/Th17依赖性途径促进炎症诱导的CRC的发生[8,30,39]。Wu等[8]探索了ETBF诱导的结肠炎和癌变的潜在机制，发现ETBF持续地在Min小鼠体内定殖，并快速、强烈地选择性激活Stat3，而不产毒素的NTBF菌株定殖，既不诱导结肠炎也不诱导Stat3激活。ETBF诱导的结肠炎的特征是选择性Th17应答，结肠肿瘤形成显著增加。Th17应答直接导致ETBF诱导的肿瘤发生。这些结果揭示了一个由ETBF诱导的结肠癌发生的Stat3和Th17依赖性途径，从而确定了适应性免疫在CRC发病机制中的独特作用。ETBF已被证明通过激活促炎性细胞因子和上调Wnt信号促进结肠直肠肿瘤的发生，这些机制可能代表了结直肠癌发生的早期事件。

Hajishengallis等[39]、Yu等[49]特别提出，某些细菌，如ETBF，可作为“基石”或“驱动”病原体，促进建立营养不良的微生物群落来诱导结直肠癌。O′Keefe[50]发现在apc缺陷小鼠中，这种BFT可导致白细胞介素17(IL-17)依赖性炎症，并诱导远端结直肠癌的发展。因此，结肠上皮细胞在ETBF长期定殖可能会增加结直肠癌的风险。

2.2.5 ETBF导致CRC的直接证据 上述研究表明，ETBF可能通过调节黏膜免疫反应、诱导上皮细胞变化等途径而在结直肠癌(CRC)的发生和发展中起作用，但均为非直接证据。香港中文大学的于君教授团队与第三军医大学的研究人员合作，给氧化偶氮甲烷(AOM)和抗生素处理过的小鼠分别移植CRC患者和健康人的粪便，结果显示，移植了结直肠癌患者粪便的小鼠息肉发生率显著高于移植健康粪便组，且息肉的数量也明显更多。息肉的出现是AOM诱导的小鼠发生CRC的“必经之路”及“癌前特征”。除了息肉外，CRC组小鼠有9只肠道都出现了明显的炎症，这也是CRC发生发展的主要致病因素。对小鼠粪便微生物群分析发现，移植了CRC患者粪便小鼠肠道中的微生物丰度相比移植健康人粪便组明显下降，随着时间的推移，在32周中，BF的数量逐渐增加，BF可以产生细菌毒素，激活多条与癌症发生有关的信号通路，而普氏栖粪杆菌(Faecalibacteriumprausnitzii)等一些抗炎细菌则逐渐减少。该研究为肠道菌群如何影响CRC的发生和发展提供了新的“直接证据”[51]。

2.3 NTBF多种途径抗肠道炎症从而抑制CRC发生

为了解肠道细菌如何在人类健康和疾病状况中发挥关键作用，科学家使用动物模型进行研究以揭示体内微生物群的确定功能。通过此类研究，已经确定了某些细菌抵抗肠道炎症的保护机制，并认识到了其重要性[10,52]，发现胃肠道中的微生物群可以调节宿主的新陈代谢，并塑造免疫系统以保护人体健康[53-54]。业已表明，人类优势共生菌BF可预防动物的肠道炎性疾病，NTBF可以促进免疫系统成熟、抑制异常炎症和改变肠道微生物群落的结构而对宿主健康有益[55-56]。

2.3.1 NTBF产生的PSA可以抑制肠道炎症 NTBF产生的胞外多糖具有多个组分，其主要免疫成分是被称为多糖A(PSA)的分子，后来被证明在每个重复亚基中均包含正电荷和负电荷。PSA是BF的免疫优势荚膜多糖，由数百个四糖重复单元组成，分子量约为110 kDa[57]。

Mazmanian 等[58]、Round等[59]发现BF可以保护动物免受致病性共生细菌幽门螺杆菌(Helicobacterhepaticus)感染而患结肠炎，其原因在于BF可作为免疫激活剂激活调节性T-细胞，后者通过分泌白细胞介素-10(IL-10)达到有效抑制促炎因子白细胞介素-17(IL-17)的作用，从而抑制肠炎的发生。进一步研究发现，在携带不表达免疫调节分子PSA的BF的动物中，幽门螺杆菌定殖会导致疾病和结肠组织中促炎性细胞因子的产生；在CD4+CD45RbhighT细胞转移或2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)诱导的小鼠模型中，BF可以通过诱导产生抗炎性细胞因子白介素10(IL-10)来防止结肠炎的发展。Chu等[60]也发现NTBF分泌的PSA可以诱导T调节性白细胞表达IL-10，并以NOD2和ATG16L1依赖性方式保护黏液免受结肠炎的侵害。说明PSA是BF在肠道组织中诱导抗炎免疫反应，从而成为预防肠道炎症性疾病的关键[61]。

用纯化的PSA进行的一些研究，也证明了PSA可以抑制肠道免疫细胞IL-17的产生[58-59]，诱导CD4+T细胞的增殖和活化。从用PSA免疫的动物中分离出的CD4+T细胞上调了T细胞活化细胞因子IL-2的表达，并且在体外实验中纯化的PSA诱导了在抗原呈递细胞(APC)存在下培养的CD4+T细胞的增殖[62]。Tzianabos等[63]发现，脾细胞制剂中CD4+T细胞的耗竭导致PSA诱导的增殖丧失，PSA诱导了人CD4+T细胞的增殖和活化，但没有诱导CD8+T细胞的增殖和活化，这一观察结果进一步表明PSA作用仅涉及特定的T细胞群体。B细胞本身就是APC，在受到常规多糖的适当刺激后会增殖。PSA介导的CD4+T细胞活化需要APC，这一发现对人们全面理解PSA生物学功能产生了深远影响，并最终阐明了为什么共生细菌可能已进化出诱导保护性T-细胞反应的能力[61]。

进一步研究发现，BF产生的PSA通过激活Toll样受体2 (TLR2)信号传导赋予其有益功能，有助于宿主免疫系统正确识别致病菌和非致病菌，并通过诱导调节性T细胞产生IL-10来限制病理性炎症[64-65]。这些研究充分表明，BF的抗炎作用对于预防IBD等肠道炎症很重要，该作用与其产生的PSA密切相关。

2.3.2 NTBF产生的对CRC的调节作用 肠道菌群失调是IBD和CRC的关键因素，而慢性IBD是CRC发生的最重要原因。为确定BF是否调节CRC，科学家采用乙氧基甲烷(AOM)/右旋葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的动物模型进行了研究，发现用BF可改善乙氧基甲烷/右旋糖酐硫酸钠引起的无菌小鼠的结肠炎相关CRC[66]；证明了BF通过部分抑制IL-1β和C-C趋化因子受体5(CCR5)的表达阻止了急性DSS诱导的结肠炎的发展[67]。多项研究发现BF的PSA在由AOM/DSS诱导的动物模型中抑制了与结肠炎相关的CRC的发展，并且其对CRC发生的有益作用主要由TLR2信号决定[67-68]。

智发朝等[69]发现BF在体内可诱导机体产生抗肿瘤效应，抑制肿瘤生长，促进肿瘤细胞凋亡，延长生存期。BF可以有效预防CRC的发生，NTBF安全没有毒副作用，治疗效果强。研究结果表明，BTBF及其产生的PSA可以成为治疗CRC药物的新候选者，具有研发食品、保健品和药物的光明前景。

3 展 望

正常情况下，大部分肠道微生物与宿主是互利共生的，起到保护宿主肠上皮细胞DNA、提供营养物质等作用。健康的肠道微生物能促进肠道内环境的稳定，并能抑制肠道癌症[70]。当人体肠道微生物的组成受到体外环境、饮食习惯、身体疾病等的影响而失去平衡时，会对人体的健康产生不良影响。ETBF作为致病性菌株，产生的BFT降解E-钙粘蛋白，通过上调ICAM-1基因、激活Stat3/Th17途径促进肠道炎症，并导致CRC发生。而NTBF及其产生的PSA对于维持肠道健康、预防和治疗包括IBD在内的肠道炎症及CRC具有较大潜力，可以作为有开发价值的益生菌(或产物)来治疗肠源性疾病，并且可以用于制备预防和治疗肠源性疾病的药物、食品、保健品等。

但是，ETBF导致肠源性疾病的发病机制并没有完全清楚，还有待深入研究； NTBF模式III菌株具有转化为ETBF的风险，在BTBF作为益生菌开发时仅考虑没有bft基因是远远不够的，只有模式II菌株才是最安全的。