基于均匀设计法的枯草芽孢杆菌me-1的发酵培养基优化

苏荣荣 杨武 王威 赵辉 陈美杉 罗坤

摘要 为提高枯草芽孢杆菌me-1对食用菌绿霉病的防治效果，以常见绿霉病病原真菌长枝木霉（Trichoderma longibrachiatum）为指示菌，采用单因素试验和均匀设计法对菌株me-1发酵培养基的碳源、氮源、无机盐进行了筛选及优化，最终确定其最适发酵培养基：可溶性淀粉35 g，蛋白胨20 g，水1 000 mL，pH 7.2，培养条件：30 ℃， 150 r/min，接种量7.0%。优化后对木霉的抑菌率达94.55%，比优化前提高了38.03%。选用优化后的培养基，绘制菌株生长曲线，结果表明，其发酵液培养3.0 d至3.5 d可使菌株me-1的菌量达到最大。该研究结果为枯草芽孢杆菌me-1的工业化生产奠定了基础。

关键词 枯草芽孢杆菌;长枝木霉;发酵培养基优化;均匀设计

中图分类号 S 476文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2019）23-0164-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.23.047

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Optimization of Fermentation Medium for Bacillus subtilis me 1 Based on Uniform Design

SU Rong rong1，YANG Wu2，WANG Wei2 et al

（1.Institute of Edible Fungi，Hunan Agriculture University，Changsha，Hunan410128;2.College of Plant Protection，Hunan Agriculture University，Changsha，Hunan410128 ）

Abstract To improve the control effect of Bacillus subtilis against Trichoderma，the optional fermentation medium of me 1 for the production of antimicrobial substance were soluble starch 35 g，peptone 20 g，water 1 000 mL，pH 7.2 under the culture conditions：fermentationtemperature 30 ℃，rotation speed 150 r/min ，amount of inoculation 7% and twodays cultivation through single factor test and uniform design. Because of the optimization，the inhibitory rate reached 94.55%，which increased by 38.03% before the optimization.Furthermore，the growth curve of me 1 was drawn through six days cultivation by using the optimized medium，the results showed that the amount of me 1 could reach the maximum by the cultivation between 3.0 days and 3.5 days.The results of this experiment provided useful information forthe industrial production of me 1.

Key words Bacillus subtilis;Trichoderma longibrachiatum;Optimization of fermentation medium;Uniform design

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）是一类广泛存在于不同环境中需氧型革兰氏阳性菌，可产生内生芽孢，抗逆性强，能产生70多种抗菌物质，如肽类、脂肽类和氨基酸类等多种化合物[1-3]，其防病机制包括竞争作用、诱导植物抗性和拮抗作用等方面，在植物病害防治方面具有广泛的应用[4-5]。研究发现，枯草芽孢杆菌对香蕉枯萎病、小麦纹枯病、烟草赤星病等真菌性病害，烟草青枯病等细菌性病害和烟草花叶病毒等病毒性病害均有较好的防治效果[6]。木霉是国内外食用菌大规模人工栽培和菌种生产中为害严重的一种真菌性病害[7-8]，其适应性强，繁殖速度快，可侵害香菇、杏鲍菇、黑木耳等食用菌，造成严重减产甚至绝收[9-10]。笔者所在实验室前期筛选获得一株木霉拮抗菌枯草芽孢杆菌me-1，能有效防治食用菌绿霉病。为提高拮抗菌me-1对绿霉病的防治效果，笔者通过单因素试验法和均匀设计法相结合的方式对枯草芽孢杆菌的发酵培养基进行优化，并以OD600为指标绘制其生长曲线，旨在为菌株me-1的规模化生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株。供试病原真菌长枝木霉（Trichoderma longibrachiatum）和供试菌株枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）为笔者前期研究分离。

1.1.2 供试培养基。供试细菌与真菌的培养分别采用LB培养基、马铃薯琼脂葡萄糖（PDA）培养基。种子培养液为LB液体培养基，发酵初始培养基：葡萄糖20 g/L、蛋白胨10 g/L、NaCl 10 g/L、pH 7.2。

3 讨论

目前，关于微生物培养基优化的方法有单因子设计、正交设计、均匀设计、Plackett-Burman 设计等[15]。均匀设计（uniform design）是1978年由方开泰等[16]中国专家提出来的，其出发点是将设计点均匀地分散在试验范围内，所用试验点不多却能使积分值得到较好的近似，与正交设计不同，当试验因素较多时可显著减少试验次数，其试验结果不具有整齐可比性，但可结合回归分析得到较为精准的结果[17-18]。

对拮抗菌的发酵条件进行优化可以提高其对相关病原菌的防治效果，而目前关于枯草芽孢杆菌对食用菌木霉的拮抗作用鲜有报道。高越等[19]通过单因子试验和正交试验相结合的方法对枯草芽孢杆菌GS8菌株的发酵条件进行了优化，优化后GS8菌株发酵滤液对葡萄炭疽病菌的抑制率提高13.1%。张璐等[20]通过单因子碳源、氮源试验与正交试验对发酵培养基成分进行优化，优化后枯草芽孢杆菌对芒果炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）抑菌圈直径达27.3 mm，较优化前提高了13.3 mm。陈丹等[21]通过单因子变量法和均匀设计法对菌株CZB40极暗黄链霉菌（Streptomyces fulvissimus）进行发酵条件研究，经优化后，菌株CZB40无菌滤液的10倍稀释液对水稻纹枯菌丝生长抑制率最高，达94.85%，比优化前明显提高。

該研究通过单因素试验和均匀设计法对菌株me-1的发酵培养基进行了优化，最终选定可溶性淀粉为最优碳源，蛋白胨为最优氮源，CaCO3为最优无机盐，并确定了其最优发酵培养基为可溶性淀粉35 g，蛋白胨20 g，水1 000 mL，pH 7.2，培养条件：30 ℃，150 r/min，接种量为7%。以优化后的培养基为液体发酵培养基，发现枯草芽孢杆菌发酵液过滤液对木霉的抑菌率达94.55%，比优化前提高了38.03%。选用优化后的培养基，绘制菌株生长曲线，结果表明，其发酵液培养3.0～3.5 d可使菌株me-1的菌量达到最大。该研究为枯草芽孢杆菌me-1的工业化生产以及食用菌绿霉病害的有效防治提供理论依据。

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