一株马铃薯黑痣病生防菌的筛选及发酵条件优化

程永乐 路晓培 蒋莹 李国光 陈有君 霍烽 李立民

摘要 采用平板对峙法从土壤中筛选并鉴定一株马铃薯黑痣病的生防菌，并对该菌株发酵培养基和发酵条件进行了优化。结果显示，H13菌株的最优培养基组成：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，氯化钠10 g/L，葡萄糖8 g/L，蔗糖6 g/L，干酪素6 g/L，硫酸镁1 g/L;最佳培养条件为初始pH 7.2，发酵时间35 h，接种量300 μL种子液，转速180 r/min，发酵温度28 ℃。

关键词 生防菌;发酵条件;培养基

中图分类号 S 435.42文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2019）23-0153-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.23.044

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Screening of an Antagonistic Strain of Potato Black Nevoid Disease and Optimization of Fermentation Conditions

CHENG Yong le，LU Xiao pei，JIANG Ying et al

（College of Life Sciences， Inner Mongolia Agricultural University， Hohhot， Inner Mongolia 010018）

Abstract A biocontrol strain of potato black nevoid disease was screened and identified by plate confrontation method， and the fermentation medium and fermentation conditions of the strain were optimized. The results showed that the optimum culture medium of strain H13 was tryptone 10 g/L， yeast extract 5 g/L， sodium chloride 10 g/L， glucose 8 g/L， sucrose 6 g/L， casein 6 g/L， magnesium sulfate 1 g/L. The optimum culture conditions were as follow： the initial pH value of 7.2， the fermentation time of 35 h， the inoculum size of 300 μL seed solution， the rotating speed of 180 r/min， and the fermentation temperature of 28 ℃.

Key words Biocontrol bacteria; Fermentation conditions;Culture medium

马铃薯黑痣病是由立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）引起的一种土传性真菌病害，该病害既可通过土壤传播，也可通过带病种薯传播[1]，在世界各国马铃薯主产区均普遍发生，严重影响马铃薯的产量和品质[2]。目前，马铃薯黑痣病主要以化学防治为主，但化学农药污染环境，破坏生态，对食品安全产生了严重影响，因此筛选马铃薯土传病的生防菌防治马铃薯黑痣病是有效途径之一，且生防菌对生态、人类健康和环境安全[3]。笔者采用平板对峙法从土壤中筛选并鉴定一株马铃薯黑痣病的生防菌，并对该菌株发酵培养基和发酵条件进行了优化。

1 材料与方法

1.1 菌株的分离与鉴定

利用分离芽孢杆菌的方法[4]分离菌株，用平板对峙法筛选具有拮抗效果的菌株，参考文献[5]扩增16S rRNA基因，PCR产物送至北京博迈德生物有限公司进行测序。

1.2 初始发酵培养基的筛选

选择5种不同的发酵培养基，分别是1/2 R2A培养基、MS培养基、马丁培养基、高氏一号培养基、LB培养基，接种200 μL H13种子液，在28 ℃、160 r/min条件下培养40 h，测定发酵液的OD600，每种发酵培养基3次重复。

1.3 碳源、氮源、无机盐的确定

分别加入浓度为0.2%、04%、0.6%、0.8%、1.0%的麦芽糖、蔗糖、乳糖、甘露醇、葡萄糖、蛋白胨、干酪素、硫酸铵和磷酸氢二胺接种至50/100 mL三角瓶，加入浓度为0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%硫酸镁、碳酸钙和磷酸氢二钾接种至50/100 mL三角瓶，确定最优碳源、氮源、无机盐。

1.4 发酵培养基的优化

将筛选后得到的最佳碳源、氮源、无机盐3个重要的培养因素按照正交试验[6-8]L9（34）设计，pH为7.0，在28 ℃、160 r/min振荡培养40 h，以OD600作为指标考察4因素3水平对发酵培养基的影响，从而确定最佳培养基配方。

1.5 发酵条件的优化

以优化的培养基为发酵培养基，分别测定不同发酵时间初始pH（4.3、5.5、5.8、7.2、7.7、8.0、86和9.2）、發酵温度（20、25、28、30、35、40 ℃）、发酵时间（10、20、30、40、50、60、70 h）、摇床转速（150、160、180、210、230 r/min）、初始接种量（50、100、150、200、250、300、350 μL），对H13菌株OD600的影响，以初始条件为基础，每一因素的优化均在前一因素优化的基础上进行。

综上所述，H13的碳源为蔗糖和葡萄糖，最佳氮源为干酪素，最佳无机盐为硫酸镁;结合单因素试验结果进行正交试验，结果显示胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，氯化钠10 g/L，葡萄糖8 g/L，蔗糖6 g/L，干酪素6 g/L，硫酸镁1 g/L;最佳培养条件为初始pH 7.2，发酵温度28 ℃，发酵时间35 h，转速180 r/min，接种量300 μL。

參考文献

[1] FRANK JA，LEACH SS.Comparison of tuberborne and soilborne inoculum in the Rhizoctonia disease of potato[J].Phytopathology，1980，70（1）：51-53.

[2] HORNBY D.Diseases caused by soil borne pathogens[M]//JONES D G.The epidemiology of plant diseases.Netherlands：Springer，1998.

[3] 李彩虹，杨志辉，张岱，等.马铃薯枯萎病拮抗菌的筛选与鉴定[J].江苏农业科学，2018，46（13）：92-95.

[4] 杨杉杉.耐盐植物根际促生细菌筛选及其对盐胁迫小麦幼苗的促生效应研究[D].呼和浩特：内蒙古农业大学，2018.

[5] 杨鸿儒.西鄂尔多斯荒漠灌木根际细菌多样性和群落结构的研究[D].呼和浩特：内蒙古农业大学，2016.

[6] 张广臣，雷虹，何欣，等.微生物发酵培养基优化中的现代数学统计学方法[J].食品与发酵工业，2010，36（5）：110-113.

[7] 肖怀秋，李玉珍.微生物培养基优化方法研究进展[J].酿酒科技，2010（1）：90-94.

[8] 赵丽坤，郭会灿.微生物培养基优化方法概述[J].石家庄职业技术学院学报，2008，20（4）：50-52.

[9] 姬广海，吴亚鹏，白学慧，等.抗生素溶杆菌对魔芋软腐病和根际微生物多样性的影响[J].江西农业大学学报，2009，31（3）：499-503，544.

[10] 姜英华，胡白石，刘凤权.植物土传病原菌拮抗细菌的筛选与鉴定[J].中国生物防治，2005，21（4）：260-264.

[11] 王云霞，钱国良，胡白石，等.产酶溶杆菌OH11菌株摇瓶发酵条件研究[J].中国生物防治，2008，24（3）：267-271.