CIN及宫颈癌患者外周血调节性T细胞的表达及意义

唐婷婷 赵曼曼

[摘要] 目的 探讨CIN及宫颈癌患者外周血调节性T细胞的表达及意义。 方法 选取2014年1月～2018年12月我院收治的CIN（宫颈上皮内瘤变）患者20例，宫颈癌患者40例，其中Ⅰ～Ⅱ期20例、Ⅲ～Ⅳ期20例，同时选择健康志愿者20例作为对照组。采用流式细胞仪检测调节性T细胞，酶联免疫吸附法测定相关细胞因子。 结果 CIN及宫颈癌患者外周血中调节性T细胞的水平显著高于对照组，差异具有统计学意义（P<0.01）。 结论 CIN及宫颈癌患者调节性T细胞/Th17细胞间的平衡被打破，可能导致了CIN的进展及宫颈癌的发生发展。

[关键词] CIN;宫颈癌;调节性T细胞;IL-17;IL-10

[中图分类号] R711.7          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2019）31-0015-03

Expression and significance of regulatory T cells in peripheral blood of patients with CIN and cervical cancer

TANG Tingting   ZHAO Manman

Department of Obstetrics and Gynecology， Shenyang Fourth People's Hospital， Shenyang   110031，China

[Abstract] Objective To study the expression and significance of regulatory T cells in the peripheral blood of patients with CIN and cervical cancer. Methods Twenty patients with CIN （cervical intraepithelial neoplasia） and 40 patients with cervical cancer （including 20 patients with stage Ⅰ-Ⅱ cancer and 20 patients with stage Ⅲ-Ⅳ cancer） treated in our hospital from January 2014 to December 2018 were enrolled， and 20 healthy volunteers were selected as the control group. Regulatory T cells were detected by flow cytometry， and relevant cytokines were determined by enzyme-linked immunosorbent assay. Results The levels and function of regulatory T cells in peripheral blood of patients with CIN and cervical cancer were significantly higher than those of the control group， with statistically significant differences（P<0.01）. Conclusion The balance between regulatory T cells/Th17 cells in the patients with CIN and cervical cancer is destroyed， which may lead to the progress of CIN and the occurrence and development of cervical cancer.

[Key words] CIN; Cervical cancer; Regulatory T cells; IL-17; IL-10

宫颈癌作为妇科发病率较高的恶性肿瘤，正呈逐年上升的趋势，严重威胁着妇女们的生命健康。而宫颈上皮内瘤变（CIN）是宫颈癌前病变的主要疾病状态，对宫颈癌的发生发展具有重要的促进作用。Th17/Treg是CD4+T细胞的两种亚群，正常情况下，Th17/Treg细胞之间保持平衡，然而大量研究表明多种恶性肿瘤患者肿瘤组织和外周血中均出现辅助性T细胞17（Th17）/调节性T细胞（regulatory T cells，Treg）失衡，因此，认为Th17/Treg 细胞失衡与肿瘤进展关系密切[1-2]。

有研究者发现，CD4+CD25+Treg细胞在低级别CIN患者中轻度增高，在高级别CIN患者中，尤其是宫颈癌患者中显著增高[3]。同时发现CIN及宫颈癌患者中调节性T细胞数量增高者预后较差，无病生存期明显缩短，提示调节性T细胞可能是CINIII及宫颈癌的独立预后因素[4]。CD4+CD25+Treg细胞能分泌白细胞介素10（IL-10），IL-10是一种能调节细胞生长和分化并参与炎症和免疫反应的多功能细胞因子[5]。辅助性Th17型细胞以分泌IL-17为特征，可通过诱导产生多种前炎性细胞因子，参与构成肿瘤微环境[6]。有研究证实宫颈癌患者中外周血血清IL-10、IL-17的水平显著升高[4-5]。因此，本研究主要探讨人外周血CD4+CD25+Treg细胞數和血清IL-10，IL-17水平的变化与CIN及宫颈癌患者之间的关系，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择CIN（宫颈上皮内瘤变）患者20例，宫颈癌患者40例，其中Ⅰ～Ⅱ期20例（Ⅰ期9例，Ⅱ期11例）、Ⅲ～Ⅳ期20例（Ⅲ期13例，Ⅳ期7例），均选自沈阳市第四人民医院2014年1月～2018年12月就诊的患者，且经手术及病理学检查确诊的患者。CIN组中，年龄35～60岁，平均（42.5±9.5）岁，宫颈癌组中，年龄32～64岁，平均（46.4±9.0）岁，均未进行过放、化疗及激素或免疫等抗肿瘤治疗。对照组根据年龄匹配选取20名健康志愿者，年龄36～55岁，平均（44.2±8.5）岁。各组年龄比较差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。本研究获医院伦理委员会批准，所有被检者均签署知情同意书。

1.2 外周血CD4+CD25+Treg細胞检测

采集各组研究对象外周血2.5 mL，置于EDTA抗凝管中，加入淋巴细胞分离液，离心，分离获得PBMC，计数。取1×106 PBMC，加入anti-CD4-FITC及anti-CD25-APC进行细胞表面染色，4℃，2 h。破膜固定后，加入anti-Foxp3-PE进行胞内染色，清洗，重悬细胞，上机检测。anti-CD4-FITC、anti-CD25-APC及anti-Foxp3-PE均购自美国BD bioscience公司。

1.3 酶联免疫吸附法（ELISA）检测IL-17、IL-10的分泌水平

抽取各组研究对象外周血，室温静置2 h，1500 rpm，离心30 min，分离上清，-70℃保存，待测。取100 μL稀释的血清样品或梯度稀释的标准品，加入预先包被好的96孔板中。室温孵育2 h，PBS洗板3次。加入检测抗体100 μL，室温孵育2 h，PBS洗板3次。加入Streptavidin-HRP 100 μL，避光孵育20 min，洗板3次。加底物避光室温孵育30 min，加终止液50 μL。利用酶标仪，在450 nm处读板计算蛋白浓度。

1.4 统计学分析

采用SPSS22.0统计软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，采用单因素方差分析比较各组间的统计学差异，当差异有统计学意义时，采用SNK法进行组间比较，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组外周血中CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞及特异性转录因子Foxp3表达水平比较

采用流式细胞术检测各组外周血CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞的表达水平，结果表明，CIN组及宫颈癌患者外周血中CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞较对照组显著升高，差异具有统计学意义（P<0.01）。见表1。

2.2 各组外周血中IL-17及IL-10分泌水平比较

用酶联免疫吸附法检测对照组、CIN患者及宫颈癌患者外周血血清中细胞因子的分泌水平。结果显示，CIN及宫颈癌患者血清中IL-10、IL-17的分泌水平较对照组明显升高，差异均具有统计学意义（P<0.01）。见表2。

3 讨论

进入21世纪，女性癌症的发病率很高，宫颈癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，其发病率居妇科恶性肿瘤的第三位[7]。CIN是宫颈癌前病变，其持续发展即为宫颈癌。近年来有研究发现，肿瘤的发生发展与机体的免疫状态密切相关，大量研究表明恶性肿瘤患者的免疫系统处于免疫耐受或免疫缺陷状态，可以逃逸机体的抗肿瘤免疫反应[8]。有研究指出，当 Treg/Th17的平衡发生偏离时则会引起CIN的进展甚至导致宫颈癌的发生与恶化[9]。

调节性T细胞是一类具有免疫抑制功能的T细胞亚群，以表达CD4、CD25为特征性表型，不仅能对抗外源性抗原，还可以抑制对抗自身抗原的免疫应答，从而辅助肿瘤细胞逃避机体免疫系统的识别及清除[10]。研究表明调节性T细胞在妇科肿瘤的发生发展中发挥了重要的作用。调节性T细胞介导宫颈癌的免疫逃逸[11-12]。研究显示，在子宫内膜癌、卵巢癌、乳腺癌等多种肿瘤患者外周血中调节性T细胞的比例均显著升高[13-15]。

肿瘤免疫微环境是近年来的研究热点，免疫系统一方面可以通过免疫监控，抑制肿瘤发生;另一方面肿瘤组织发挥负向调控免疫系统，诱导免疫耐受，促进肿瘤恶性进展。因此，阐明宫颈癌微环境的免疫调控机制可为宫颈癌的预防及治疗提供理论基础。由于免疫调控是一个极为复杂的调控网络，宫颈癌发病机制及其具体深入的免疫调控作用仍需进一步研究证实。

本研究中，CIN及宫颈癌患者外周血中调节性T细胞的数量及功能均有明显升高，表明调节性T细胞参与了调控CIN及宫颈癌发生发展。IL-10是调节性T细胞发挥免疫抑制功能的主要细胞因子，参与调控多种肿瘤的发生发展。在CIN及宫颈癌患者外周血中，IL-10的分泌水平显著增加，表明调节性T细胞可能同样通过分泌IL-10来发挥其对CIN及宫颈癌病理进程的调控作用。另一方面，以分泌IL-17为主要特征的Th17型免疫细胞被证实参与CIN及宫颈癌的发生发展。本研究中，CIN及宫颈癌患者外周血中IL-17的分泌水平显著升高，提示Th17型炎症反应在CIN及宫颈癌中被大量诱导。调节性T细胞和Th17细胞均显著增加，意味着调节性T细胞和Th17细胞间相互平衡被打破，形成了有利于肿瘤发展的免疫炎性微环境。

综上所述，随着CIN逐渐发展为宫颈癌，辅助性T细胞17（Th17）/调节性T细胞（regulatory T cells，Treg）细胞失衡，从而导致CIN及宫颈癌的发生发展，可能参与了肿瘤免疫内环境的调节。

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（收稿日期：2019-05-20）