基于数据挖掘分析神经元正五聚体蛋白2在肾透明细胞癌中的表达及意义

林晏廷, 徐季旗, 陈洁

(暨南大学 附属第一医院 泌尿外科， 广东 广州 510632)

神经元正五聚体蛋白(neuronal pentraxins，NPTXs)是一类与C反应蛋白(C-reactive protein，CRP)和血清淀粉样蛋白P(serum amyloid P，SAP)具有同源性的蛋白家族，家族成员包括NPTX1、NPTX2和NPTXR．NPTX1仅在神经系统的大脑皮质、小脑神经元和海马等表达，而神经元正五聚体蛋白2(neuronal pentraxin-2,NPTX2)则不局限于神经系统，还可以表达于睾丸、胰岛、肾上腺等，且在睾丸、胰岛中表达最高[1]．其对促进兴奋性突触的形成和突触发育过程中的可塑性发挥重要作用[2]．有研究显示NPTX2的异常表达以及高甲基化等与帕金森病[3]、阿尔兹海默病[4-5]、神经母细胞瘤[6-7]、结直肠癌[8]、胰腺癌[9-10]等的发生发展皆有一定相关性，并可通过脱甲基化或抑制其过表达等方式影响肿瘤的增殖及迁移，使其有望成为肿瘤早期诊断、治疗及预后的生物标记物．

肾透明细胞癌(clear cell renal cell carcinoma,ccRCC)是来源于肾实质小管上皮细胞的肿瘤，约占肾脏恶性肿瘤的80%～90%[11-12]．目前已有研究指出NPTX2的表达可能与ccRCC的发生、发展有关[13-14]，但由于研究方法、样本例数及人群的差异，尚不能评价其结论一致性．本研究通过挖掘多个数据库，以大数据分别从mRNA水平和蛋白质水平上对NPTX2在正常肾组织和ccRCC组织中的表达情况进行荟萃分析，并分析其表达与ccRCC患者预后的关系．

1 资料与方法

1.1 数据库检索

1.1.1 Oncomine数据库

Oncomine 数据库是一个癌症基因芯片数据库和整合数据挖掘平台，可以对所选择的基因表达谱做可视化分析[15]．本研究设置检索条件如下：①Gene：NPTX2；②Analysis Type：Cancer vs. Normal Analysis；③Cancer Type：Kidney Cancer；④Cancer Type：Clear Cell Renal Cell Carcinoma；⑤Data Type：mRNA；⑥Threshold By：P-value<1E-4；Fold Change>2；Gene Rank：Top 10%．

1.1.2 GEPIA 数据库

GEPIA 数据库基于TCGA和GTEx数据库的 8 587个正常组织样本，9 736个肿瘤组织样本的RNA测序表达数据，包含33种恶性肿瘤[16]，可做特定基因在正常组织和肿瘤组织中的差异表达分析．本研究选择使用TCGA数据验证Oncomine数据库的分析结果，并且进一步分析NPTX2与ccRCC病理分期及预后的相关性．

1.1.3 人类蛋白质表达图谱

人类蛋白质表达图谱(human protein atlas，HPA)是一个基于免疫组化分析和RNA测序分析的大型转录组和蛋白组数据库,HPA数据库中的蛋白质数据覆盖了所有人类蛋白质编码基因的86%，可对肿瘤和正常组织进行蛋白的差异表达分析[17]．本研究引用数据库中NPTX2组化抗体(HPA049799、CAB020801)对正常肾组织和ccRCC组织进行免疫组化实验，提取 3例正常肾组织和3例典型ccRCC组织，分析NPTX2蛋白的表达及抗体染色程度．

1.1.4 MethHC 数据库

MethHC是一个关于肿瘤基因表达和DNA甲基化的综合数据库，整理了TCGA数据库中肿瘤和正常组织的DNA甲基化和mRNA /miRNA表达谱[18]．本研究使用MethHC分析NPTX2在ccRCC组织中的甲基化水平，设置检索条件如下：①Search by：gene；②Cancers：KIRC；③Gene region：Promoter；④Select a methylation lever evalution method：Average；⑤Gene search：NPTX2．

1.1.5 String-DB

String-DB是一个分析生物学基因或蛋白相互作用的数据库，整合了已知和可预测的蛋白质-蛋白质相互作用的生物数据[19-20]．该数据库可为本研究提供NPTX2与上下游蛋白的相互作用分析．设置检索条件如下：①Protein Name：NPTX2；②Organism：Homo sapiens；③Minimum required interaction score：medium confidence(0.400)；④Max number of Interactors：no more than 20 interactors．

1.2 统计学方法

统计学分析采用SPSS 13.0软件处理数据.分析NPTX2在正常肾组织和ccRCC组织中的表达差异情况时，用t检验或Wilcoxon秩和检验进行非配对样本的组间比较；用配对t检验进行配对样本的组间比较；用one-way ANOVA分析NPTX2mRNA表达与ccRCC临床病理分期间的关系；用Kaplan-Meier法对ccRCC患者进行生存分析；用Cox比例风险回归模型分析NPTX2mRNA表达与ccRCC患者预后的关系.P<0.05为有统计学差异.

2 结果

2.1 NPTX2 mRNA在其他肿瘤组织和ccRCC组织中的表达

通过Oncomine数据库分析NPTX2在20项肿瘤中的表达水平，与其他肿瘤组织相比，NPTX2mRNA在肾癌中表达增高(图1)．按照前述条件，得出子数据库Beroukhim Renal[21]、Jones Renal[22]、Gumz Renal[23]和Lenburg Ranal[24]的5项研究(图2)．

图1 Oncomine数据库中NPTX2mRNA在所有肿瘤研究中的表达

Fig.1 The expression ofNPTX2mRNA in all oncological studies of Oncomine database

Beroukhim Renal数据库中有70个样本、12 624个被检基因，在遗传性ccRCC中，NPTX2在过表达基因中排第397位(前4%)，差异倍数=7.961，P=7.62×10-10；在非遗传性ccRCC中，NPTX2在过表达基因中位于第127位(前2%)，差异倍数=23.543，P=7.53×10-11．Jones Renal数据库中有92个样本、12 624个被检基因，NPTX2在过表达基因中位于第779位(前7%)，差异倍数=18.745，P=1.29×10-10．Gumz Renal数据库中有20个样本、12 624个被检基因，NPTX2在过表达基因中排第424位(前4%)，差异倍数=54.781，P=2.00×10-6．Lenburg Ranal数据库中有18个样本、17 779个被检基因，NPTX2在过表达基因中排第769位(前5%)，差异倍数=9.920，P=6.38×10-4．在5项研究中，NPTX2mRNA在ccRCC中的表达皆高于正常组织(表1)．而对5项研究结果荟萃分析得出，与正常组织组相比，NPTX2mRNA在ccRCC中高表达(P=2.00×10-6)．

A:Beroukhim Renal(遗传性ccRCC);B:Beroukhim Renal(非遗传性ccRCC);C:Jones Renal;D:Lenburg Renal;E:Gumz Renal.

研究项目ccRCC组织样本量正常肾组织样本量差异倍数PtBeroukhim Renal(遗传性ccRCC)32117.9617.62E-107.931Beroukhim Renal(非遗传性ccRCC)271123.5437.53E-119.541Jones Renal232318.7451.29E-1010.626Lenburg Ranal999.9206.38E-044.728Gumz Renal101054.7812.00E-068.617

使用GEPIA分析595个TCGA数据库来源的样本，其中正常肾组织72例，ccRCC组织523 例，可见与正常肾组织相比，NPTX2mRNA在ccRCC中高表达(P<0.05)，与Oncomine数据库结果相符(图3)．

2.2 NPTX2 mRNA表达与ccRCC临床病理分期的关系

在GEPIA使用TCGA数据分析NPTX2mRNA表达与ccRCC临床病理分期的关系，使用one-way ANOVA，以病理分期为变量计算差异表达，根据患者病理主要阶段生成小提琴图，结果显示：NPTX2mRNA表达水平与ccRCC临床病理分期呈正相关，高级别分期与低级别分期相比，NPTX2mRNA高表达核心密度带宽更高，有统计学差异(P=2.61×10-3)(图4)．

图3 GEPIA数据库中NPTX2 mRNA在ccRCC组织中的表达

Fig.3 Expression ofNPTX2mRNA in ccRCC tissues of GEPIA database

图4 GEPIA数据库中NPTX2mRNA表达与ccRCC病理分期的关系

Fig.4 Relationship betweenNPTX2mRNA expression and pathological stage of ccRCC in GEPIA database

2.3 NPTX2 mRNA表达与ccRCC患者预后的关系

通过GEPIA使用TCGA 数据分析NPTX2mRNA表达与ccRCC患者预后的关系，得出NPTX2mRNA高表达患者129例与低表达患者128例的总体生存率以及无病生存率曲线．结果显示：NPTX2mRNA高表达患者其总体生存率明显低于低表达患者(LogrankP=6.6×10-3，HR=1.8，P(HR)=7.2×10-3)(图5)；此外，NPTX2mRNA高表达患者的无病生存率亦低于低表达患者(LogrankP=4×10-4，HR=2.6，P(HR)=6.6×10-4)(图6)．NPTX2高表达可能是ccRCC患者生存率降低的风险因素．

图5 GEPIA数据库中NPTX2mRNA不同表达的ccRCC患者总体生存率

Fig.5 Overall survival rate of ccRCC patients with differentNPTX2mRNA expression of GEPIA database

图6 GEPIA数据库中NPTX2mRNA不同表达的ccRCC患者无病生存率

Fig.6 Disease free survival rate of ccRCC patients with differentNPTX2mRNA expression of GEPIA database

2.4 NPTX2蛋白在正常肾组织和ccRCC组织中的表达情况

在HPA数据库中，采用NPTX2组化抗体(HPA049799、CAB020801)分析正常肾组织和ccRCC组织的免疫组化结果，在3例正常肾组织中肾小管细胞中抗体染色均为“低”水准，肾小球细胞中分布极少，未检测出；在3例ccRCC患者肿瘤细胞中均呈“高”水准(图7)．由此进一步证实NPTX2蛋白在ccRCC中较正常肾组织高表达．

图7 NPTX2蛋白在ccRCC组织与正常肾组织中的表达(免疫组化染色)

2.5 ccRCC中NPTX2的DNA甲基化水平

在MethHC数据库中得出NPTX2的甲基化转录模板NM_002523；在ccRCC与正常肾组织的甲基化水准差异分析中，其在ccRCC中的甲基化水平较正常组织高，有统计学差异(P<0.005)(图8)；并且在ccRCC中NPTX2启动子区甲基化水平较正常组织甲基化水平明显升高(图9)．

2.6 NPTX2与上下游蛋白的相互作用

使用String-DB分析NPTX2与上下游蛋白的相互作用，按照前述条件得出NPTX2蛋白交互作用网络图(图10)，PPI富集P值 (protein-protein interaction enrichment p-value)=6.68×10-4，相互作用的节点数为21个，其中在 PPI网络中与NPTX2相互作用(score>0.400)的有AVP、MT-ATP6、MT-ATP8、MT-ND4、NPAS4、CBLN1、BDNF、TYMP等，主要参与了氧化磷酸化、ATP代谢过程、细胞间信号传导、调节神经冲动的传递、兴奋性突触后电位等生物过程．

图8 正常肾组织和ccRCC组织NPTX2甲基化水平比较

Fig.8 Comparison of NPTX2 methylation level in normal kidney tissues and ccRCC tissues

图9 正常肾组织和ccRCC组织NPTX2启动子区甲基化水平比较

图10 NPTX2蛋白交互作用网络图

3 讨论

肾脏恶性肿瘤占所有肿瘤的3.8%，是常见的恶性肿瘤之一，近年来发病率呈逐年上升趋势，在过去20年，全球发病率增加了2%．ccRCC是其中最常见的类型，男性与女性的发病比例为1.5∶1，60～70岁发病率最高．ccRCC的预后较其他RCC更差，28%的ccRCC患者在确诊时已经是晚期疾病，主要采用外科手术治疗，其他治疗方案如化疗和放疗等的效果并不明显，仍存在复发率高和预后差的问题[11-12]．现普遍依据2016版WHO/ISUP对ccRCC进行分级、治疗指导及预后评估，但仍没有适合常规使用的预测性分子生物标志物[25]．多项研究显示ccRCC的相关分子标记物如CAIX，PTEN和CXCR4中没有一个明显改善了当前预后系统的预测准确性[12]，因此，进一步探索其生物学标志物和治疗靶点等对ccRCC患者有重要的临床意义．

1995年，Hsu等[1]在分离NPTX1的人同源物时，首次报道了NPTX2，长度为11 kb，包含了4个内含子，并定位于染色体7q21.3-q22.1．NPTX2是NPTX家族中的成员, 成员包括NPTX1、NPTX2和NPTXR．NPTX家族与CRP和SAP等急性反应蛋白同源，并且与兴奋性突触的形成和突触发育过程相关[2]．NPTX2具有Ca2+依赖的凝集素结合活性，其特性有助于其黏附于细胞膜上，调节突触前物质的摄取，在突触形成和重塑过程中可以调节突触中降解物质的摄取[26]．此外，NPTX2还可与NPTXR形成多聚体混合物，作用于细胞膜表面，与AMPA选择性谷氨酸受体亚基结合，以促进兴奋性突触的形成和发育，或调节突触前物质的摄取，是一种细胞外AMPA受体聚集因子[4]．Ishiuchi等[27-28]的研究中提到，由AMPA介导的Ca2+信号通过激活受体Akt可以调节神经胶质母细胞瘤细胞的增殖和迁移．Ca2+渗透性AMPA受体的激活在神经胶质母细胞瘤的生长中有重要作用．在ccRCC中NPTX2的作用可能亦与此相关．

Von Roemeling等[13]的研究发现NPTX2的活性介导了ccRCC肿瘤细胞的存活和侵袭，机制与AMPA选择性谷氨酸受体4(GluR4)有关，在正常的生理环境中，GluR4的表达主要定位于中枢神经系统中特定的神经元和神经胶质细胞，介导快速突触神经传递，NPTX2在GluR4的突触募集中发挥重要作用[26]．NPTX2可与ccRCC细胞膜上的GluR4相连形成复合物AMPAR, AMPAR通过介导增加细胞内Ca2+的流入，导致肌动蛋白细胞骨架的重组，并促进细胞的增殖与迁移．Von Roemeling等[13]还发现可以通过使用变构AMPA受体拮抗剂CFM-2来减少NPTX2的过表达，从而抑制ccRCC肿瘤细胞的增殖．由此可见，抑制NPTX2与GluR4结合形成AMPAR，可能对转移性ccRCC有一定意义，NPTX2有望成为ccRCC的诊断标志物以及治疗靶点．

本研究分别分析了Oncomine数据库中Beroukhim Renal等4个子数据库的5项研究，并进行荟萃分析，得出与正常组织组相比，NPTX2mRNA在ccRCC中存在显著高表达．并以GEPIA对TCGA数据进行分析，验证结果与 Oncomine 数据库一致，即NPTX2mRNA在ccRCC中高表达．

目前普遍采用世界卫生组织(WHO)与国际泌尿外科病理学会(ISUP)于2012年提出的ccRCC病理分期系统作为ccRCC的预后指标，该系统基于肿瘤的核仁评估分期：G1期：400倍光镜下肿瘤细胞无核仁或核仁不明显；G2期：400倍光镜下肿瘤细胞可见清晰核仁，但在100倍光镜下核仁不明显或不清晰；G3期：100倍光镜下可见清晰的核仁；G4期：可见明显多形性的核仁、肿瘤巨细胞和/或肉瘤样形态或横纹肌样分化[29-30]．在GEPIA的分析结果中得出，高级别分期与低级别分期相比，NPTX2mRNA高表达核心密度带宽更高，即NPTX2mRNA表达水平与ccRCC临床病理分期呈正相关．

此外，NPTX2高表达的ccRCC患者总体生存率以及无病生存率皆明显低于低表达患者，NPTX2的高表达可能是ccRCC患者生存率降低的风险因素．而HPA数据库的免疫组化分析结果亦证实，NPTX2蛋白在ccRCC中也较正常肾组织高表达，并且在MethHC数据库进行的甲基化水准差异分析得出，ccRCC中NPTX2启动子区甲基化水平明显增高．

使用String-DB分析发现，NPTX2与AVP、MT-ATP6、MT-ATP8、MT-ND4、NPAS4、CBLN1、BDNF、TYMP等蛋白存在相互作用，主要参与氧化磷酸化、ATP代谢过程、细胞间信号传导、调节神经冲动的传递、兴奋性突触后电位等生物过程．其中，NPTX2与MT-ATP6、MT-ATP8、MT-ND4协同参与了氧化磷酸化(GO：0006119)、ATP代谢过程(GO：0046034)．通过呼吸链的操作，伴随代谢物氧化的ADP磷酸化为ATP．氧化化合物会在细胞膜上建立质子梯度，从而为ATP合成提供能量.另外，NPTX2与AVP、CBLN1、BDNF、NPAS4等蛋白协同参与了细胞间信号传导(GO：0007267)，过程包括接收细胞中的转导信号、一定条件下配体的释放，以及促进其转运和呈递至接收细胞的过程．例如通过可溶性配体，通过细胞粘附分子和通过间隙连接的信号传导等．而NPTX2与AVP、TYMP可协同参与调节神经冲动的传递(GO：0051969)，通过调节神经冲动的频率、速率或程度，响应在神经元膜上刺激传播的顺序及电化学极化和去极化的过程．NPTX2与NPAS4、GRIA2、GRIA4协同参与兴奋性突触后电位(GO：0060079)，即带正电离子流入突触后细胞而导致突触后电位暂时增加的过程，通过引发兴奋性突触后电位的离子流，引发兴奋性突触后电流，可使神经元更容易激发动作电位．

综上所述，本研究结果显示NPTX2在ccRCC组织中呈高表达，且其表达与患者预后相关．将有可能成为ccRCC的诊断标志物以及治疗靶点，有必要对NPTX2与ccRCC的治疗靶点及转移风险的预测进行更深入的探究，本研究为后续的研究提供了线索和理论依据．本研究不足之处，NPTX2与ccRCC的相关分析是从各个公开资料库进行数据挖掘综合分析而得出，其数据样本来源大多非中国人，实为一种探索型研究，需要更多实验研究以及我国临床样本加以验证．