大黄黄连泻心汤对2 型糖尿病大鼠骨骼肌中AMPKα、PGC-1α、GLUT4 表达的影响

郝建华 包毅敏 包 芸 鹿 伟 张超伟 郝艺杰

1.内蒙古医科大学中医学院，内蒙古呼和浩特 010030；2.内蒙古医科大学附属医院骨科，内蒙古呼和浩特 010050；3.内蒙古医科大学附属医院中医科，内蒙古呼和浩特 010050

随着人们生活水平和饮食结构的改变，糖尿病（diabetes mellitus，DM）发病率呈逐年上升趋势，已经成为继心血管疾病和肿瘤之后，排名第三位的威胁人类健康的慢性系统性疾病［1-2］。DM 中90%以上的患者属于2 型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM），其发病率高，病程长，易引发心脑血管、肾脏、神经系统等多种并发症，使T2DM 的预防和治疗成为研究的热点；T2DM 的发病因素多，病理机制复杂，研究发现，其发病机制与体内多种代谢相关酶、血糖调节相关信号通路关系密切，腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-acticated protein kinase，AMPK）、PI3K/Akt、缺氧诱导因子（HIF-1）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、血管内皮生长因子（VEGF）、FoxO、NF-κB 等多种信号通路广泛参与了血糖的调控［3-4］，使T2DM 的发病机制成为研究的难点。通过对T2DM 代谢相关信号通路的研究，明确作用靶点，开发调节血糖代谢相关信号通路的抑制剂或激活剂，对临床治疗具有重要意义。

中药治疗T2DM 具有多途径、多通道、多靶点、多效应的优势，在临床中被广泛应用。大黄黄连泻心汤出自《伤寒杂病论》，临床应用能够降糖、降脂、减轻体重，能够改善患者多饮、多食等症状，对于T2DM 有较好的疗效［5-8］。本实验采用高糖高脂饲料联合小剂量链脲佐菌素（STZ）法构建T2DM 大鼠模型，观察大黄黄连泻心汤对糖脂代谢的影响，对骨骼肌中腺苷酸活化蛋白激酶α（AMPKα）、过氧化物酶体增殖活化受体γ共激活因子-1α（peroxisome proliferator activated receptor-γ coactivator-1α，PGC-1α）、葡萄糖转运蛋白4（glucose tRNAsporter 4，GLUT4）表达的影响，探讨大黄黄连泻心汤调节糖脂代谢与AMPK 信号通路的相关性，寻找其作用靶点，为临床应用提供理论和实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与饲料

SPF 级健康雄性Wister 大鼠40 只，体重（200±20）g，8 周龄，购自内蒙古医科大学实验动物中心。动物生产许可证号：SCXK（蒙）2015-0001，SPF 级使用环境由内蒙古医科大学实验动物中心提供，动物使用许可证号：SYXK（蒙）2015-0001，经内蒙古医科大学医学伦理委员会批准，饲养于内蒙古医科大学实验动物中心非屏障室，室温20℃，湿度50%～70%，光暗周期（12 h/12 h），动物自由摄食饮水；高糖高脂饲料（猪油10%、糖20%、胆固醇2.5%、胆酸钠0.5%、基础饲料67%）购于北京科澳协力饲料有限责任公司。

1.2 实验药物及主要试剂

大黄黄连泻心汤（根据《金匮要略》所载的配比剂量，大黄∶黄连∶黄芩为2∶1∶1）购于内蒙古自治区中医院；二甲双胍（北京利龄制药厂，生产批号：161014）；STZ（美国SIGMA 公司，货号：SO-130，批号：18883-66-4）；大鼠葡萄糖试剂盒（上海荣盛生物药业有限公司，批号：YZB/沪2624-40-2014）；三酰甘油（TG）ELISA 试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号：A110-1）；总胆固醇（TC）ELISA 试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号：A111-1）；低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）ELISA 试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号：A113-1）；Phospho-AMPKα（Thr172）（40H9）Rabbit mAb（美国CST 公司，批号：CST 2535S）；AMPKα Rabbit mAb（美国CST公司，批号：CST 2603S）；PCG-1α Mouse mAb（美国CST 公司，批号：CST 2705S）；GLUT4 Mouse mAb（美国CST 公司，批号：CST 2823S）；AMPKα PGC-1α GLUT4 引物设计合成（生工生物工程股份有限责任公司，批号：111085660）；血糖仪（北京华益静点生物技术有限公司，批号：878P19904000266）；PrimeScript RT 试剂盒（thermo 公司，批号：K1622）；BCA 试剂盒（Solarbio 公司，批号：PC0020）。

1.3 造模方法

40 只大鼠适应性喂养7 d 后，采用随机数字表法分为空白对照组10 只和造模组30 只。空白对照组以普通饲料喂养，造模组以高糖高脂饲料喂养，4 周后禁食12 h，造模组腹腔内注射STZ（25 mg/kg），空白对照组注射等体积柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。各组按照原方案继续喂养7 d 后，禁食12 h，取尾静脉血，用血糖仪测定空腹血糖（FPG），以FPG≥7.8 mmo1/L 作为T2DM 模型成功与否的判断标准［9-10］，造模组90%达到标准。3 只大鼠造模未成功，再次腹腔内注射半剂量STZ（12.5 mg/kg），再以上述指标评估，均造模成功。造模成功后所有大鼠以普通饲料喂养。

1.4 动物分组与给药方法

将造模成功的30 只大鼠按照随机数字表法分为中药组、二甲双胍组、模型组，每组10 只。中药组以大黄黄连泻心汤灌胃，按照《动物与人体的每公斤体重计量折算系数表》折算，给药量为1 g/（100 g·d），二甲双胍组按照18 mg/（100 g·d）以二甲双胍灌胃，模型组、空白对照组予以等体积的生理盐水灌胃，共4 周。实验过程中有3 只大鼠死亡，空白对照组、中药组及模型组各1 只，空白对照组及中药组大鼠死亡前发现有鼻及口腔出血现象，死亡后经解剖发现肺中有残留液体，余脏器未见明显异常，推测其死因可能是由灌胃手法不当引起，模型组死亡大鼠经解剖发现胃肠高度胀气、肠梗阻，推测为急性酮症酸中毒所致。

1.5 标本取材与检测

1.5.1 血糖、血脂测定 分别于药物治疗前、治疗4 周后，禁食12 h，取各组大鼠尾静脉血，用血糖仪测定FPG。实验结束后，所有大鼠禁食12 h，腹腔注射20%乌拉坦（5 mL/kg）麻醉、处死，腹主动脉取血，离心机3000 r/min，离心10 min，离心半径8 cm，分离出血清，送至内蒙古医科大学分子生物学研究中心，-70℃冰箱保存。ELISA 法检测FPG、TC、TG、LDL-C。

1.5.2 胰腺组织病理学观察 实验结束后，切取胰腺组织，浸泡于10%的甲醛溶液中固定，后送至内蒙古医科大学分子病理学实验室。胰腺组织冲洗后，梯度乙醇脱水，二甲苯浸泡透明，浸蜡包埋，切片烘干，切片厚度4 μm，进行苏木精-伊红（HE）染色。经脱腊，水化，HE 染色，脱水，透明后封固，于光镜下观察胰腺组织细胞形态，显微摄影。

1.5.3 RT-PCR 检测 实验结束后，所有大鼠取右后肢大腿骨骼肌，保于液氮中冷却30 min，送至内蒙古医科大学分子生物学研究中心，-80℃冰箱保存，进行骨骼肌中AMPKα、PGC-1α、GLUT4 的mRNA 检测。所有大鼠各称取60 mg 骨骼肌，研磨、冷却后，加入Trizol溶液裂解，提取RNA，用紫外分光光度计测定RNA 浓度，光密度（OD）260 与OD280 比值在1.8～2.0 之间，以2 μg 的RNA 为基本模板量，应用PrimeScript RT试剂盒，将RNA 逆转录出cDNA，以GAPDH 为内参，加入AMPKα、PGC-1α、GLUT4 上下游引物，配置PCR扩增体系，反应条件为：94℃×2 min，94℃×2 s，50℃×2 s，72℃×2 s，共40 个循环，每个样本重复3 次，用2-ΔΔCt数值来分析AMPKα、PGC-1α、GLUT4 的mRNA 表达量。见表1。

表1 AMPKα、PGC-1α、GLUT4 引物序列表

1.5.4 Western blot 检测 测定骨骼肌中AMPKα、磷酸化的腺苷酸活化蛋白激酶α（P-AMPKα）、PGC-1α、GLUT4 蛋白表达量。所有大鼠各取称取50 mg 骨骼肌，RIPA 细胞裂解液裂解提取蛋白，用BCA 试剂盒测定蛋白含量后，每组各取50 μg，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酞（SDS-PAGE）凝胶电泳，转移至硝酸纤维素（NC）膜，之后孵一抗Phospho-AMPKα 抗体（1 ∶1000）、AMPKα 抗体（1 ∶1000）、PCG-1α 抗体（1∶1000）、GLUT4 抗体（1∶1000）及内参GAPDH 抗体（1∶800），4℃反应过夜，TBS-T 漂洗后，相应二抗工作液（1∶800）37℃孵育，TBS-T 漂洗，使用ECL 发光显色液曝光，压片，显影并定影，扫描仪扫描图片，用Image J软件分析每个条带的荧光强度值，每组实验重复3次。

1.6 统计学方法

采用SPSS 20.0 统计学软件对数据进行分析，计量资料采用均数±标准差（）表示，组内比较采用t检验，多组间比较采用方差分析，组间两两比较采用LSD-t 检验，以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组治疗前后尾静脉FPG 比较

造模后，造模组FPG 显著高于空白对照组，差异有高度统计学意义（P ＜0.01）；中药组、二甲双胍组治疗后FPG 较治疗前显著降低，差异有高度统计学意义（P ＜0.01）。见表2。

表2 各组治疗前后尾静脉FPG 的比较（mmol/L，）

表2 各组治疗前后尾静脉FPG 的比较（mmol/L，）

注：与空白对照组治疗前比较，#P ＜0.01。FPG：空腹血糖

2.2 各组治疗后FPG、TC、TG、LDL-C 比较

与空白对照组比较，模型组TC、TG、LDL-C 均显著升高，差异有高度统计学意义（P ＜0.01 或P ＜0.05）。与模型组比较，治疗后中药组及二甲双胍组FPG、TC、TG、LDL-C 均显著降低，差异有统计学意义（P ＜0.05 或P ＜0.01）。中药组与二甲双胍组FPG、TC、TG、LDL-C 比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。见表3。

表3 各组治疗后FPG、TC、TG、LDL-C 比较（mmol/L，）

表3 各组治疗后FPG、TC、TG、LDL-C 比较（mmol/L，）

注：与空白对照组比较，△P ＜0.05，△△P ＜0.01；与模型组比较，*P ＜0.05，**P ＜0.01。FPG：空腹血糖；TC：总胆固醇；TG：三酰甘油；LDL-C：低密度脂蛋白胆固醇

2.3 胰腺组织病理学观察

空白对照组：胰岛β 细胞数量多，呈团索状分布，结构完整，细胞边界清楚，胞浆丰富，细胞核清晰可见；模型组：胰岛β 细胞数量减少，外形较小，胞浆少，细胞核致密、溶解，出现透明样变，部分细胞出现空泡样变性。与模型组比较，中药组和二甲双胍组胰岛结构较完整，胰岛β 细胞数量有所增加，空泡细胞减少，细胞变性程度较轻，细胞核清晰可见。见图1。

图1 各组大鼠胰腺HE 染色表现（400×）

2.4 各组AMPKα、PGC-1α、GLUT4的mRNA表达比较

与空白对照组比较，模型组大鼠骨骼肌中AMPKα、GLUT4 及PGC-1α 的mRAN 表达量显著降低，差异有统计学意义（P ＜0.05 或P ＜0.01）；与模型组比较，中药组PGC-1α、GLUT4 及AMPKα 的mRAN 表达量增高，差异有统计学意义（P ＜0.05 或P ＜0.01）；二甲双胍组AMPKα、PGC-1α、GLUT4 的mRAN 表达量显著增高，差异有统计学意义（P ＜0.01）；中药组与二甲双胍组AMPKα、PGC-1α、GLUT4 的mRAN 表达量比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。见表4。

2.5 各组P-AMPKα、AMPKα、PGC-1α、GLUT4、GAPDH蛋白表达水平比较

与空白对照组比较，模型组大鼠骨骼肌中PAMPKα、AMPKα、PGC-1α、GLUT4 蛋白表达量显著降低，差异有高度统计学意义（P ＜0.01）；与模型组比较，中药组P-AMPKα、PGC-1α、GLUT4 及AMPKα 蛋白表达量显著增高（P ＜0.05 或P ＜0.01）；二甲双胍组P-AMPKα、AMPKα、PGC-1α、GLUT4 蛋白表达量显著增高，差异有高度统计学意义（P ＜0.01）。中药组与二甲双胍组，AMPKα、PGC-1α、GLUT4 蛋白表达量比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。中药组、二甲双胍组P-AMPKα/ AMPKα 显著高于模型组（P ＜0.01），差异有统计学意义。见表5、图2。

表4 各组AMPKα、PGC-1α、GLUT4 的mRNA 表达比较（）

表4 各组AMPKα、PGC-1α、GLUT4 的mRNA 表达比较（）

注：与空白对照组比较，△P ＜0.05，△△P ＜0.01；与模型组比较，*P ＜0.05，**P ＜0.01。AMPKα：腺苷酸活化蛋白激酶α；PGC-1α：过氧化物酶体增殖活化受体γ 共激活因子-1α；GLUT4：葡萄糖转运蛋白4

表5 各组P-AMPKα、AMPKα、PGC-1α、GLUT4 蛋白表达水平的比较（）

表5 各组P-AMPKα、AMPKα、PGC-1α、GLUT4 蛋白表达水平的比较（）

注：与空白对照组比较，△△P ＜0.01；与模型组比较，*P ＜0.05，**P ＜0.01。P-AMPKα：磷酸化的腺苷酸活化蛋白激酶α；AMPKα：腺苷酸活化蛋白激酶α；PGC-1α：过氧化物酶体增殖活化受体γ 共激活因子-1α；GLUT4：葡萄糖转运蛋白4

图2 各组AMPKα、P-AMPKα、PGC-1α、GLUT4、GAPDH 蛋白表达水平

3 讨论

T2DM 的主要发病机制为胰岛素抵抗和胰岛素分泌障碍，在疾病的发生发展过程中，高血糖和脂代谢紊乱又进一步降低胰岛素敏感性，并损伤胰岛β 细胞功能，这是T2DM 发病机制中最重要的获得性因素。研究发现，糖脂代谢紊乱与体内多种代谢相关信号转导机制有密切关系，由于AMPK 信号通路对糖脂代谢起全方位的调控作用，能够增加骨骼肌细胞对葡萄糖的摄取和代谢，增加脂肪酸氧化及减少三酰甘油合成，增加胰岛素敏感性［11-12］，因此，AMPK 一直是DM研究中的重要靶点。

AMPK 作为能量调节的关键因子，在细胞内AMP/ATP 比值升高、上游蛋白激酶等多因素的作用下被激活，使AMPK 具有活性，AMPK 被激活的标志是α 亚基第172 位苏氨酸（Thr172）的磷酸化，磷酸化的腺苷酸活化蛋白激酶（P-AMPK）通过磷酸化下游的一系列酶类底物，来调节糖脂代谢［13］。PGC-1α 是AMPK 下游的靶分子，AMPK 能够促进PGC-1α 磷酸化水平，增加它的表达量，来调控葡萄糖代谢、脂肪酸氧化及减少氧化应激等［14］。骨胳肌是摄取和消耗葡萄糖的主要外周组织，葡萄糖进入骨胳肌细胞需要细胞膜上的GLUT4 直接参与，激活的AMPK 使GLUT4 从囊泡转运至细胞膜，囊泡与细胞膜融合，才能使被插入细胞膜的GLUT4 用于转运葡萄糖，促进葡萄糖的摄取量快速增加，降低血糖，因此，P-AMPK 能够增加GLUT4 的转位，进而增强肌肉对胰岛素的反应［15］。同时，PGC-1α 又通过激活GLUT4 的上游调控子MEF2C，高效诱导GLUT4 的基因表达，使骨骼肌细胞转运葡萄糖的能力进一步提高［16］。二甲双胍作为治疗T2DM的一线用药，是AMPK 信号通路的激活剂。研究发现，二甲双胍通过抑制线粒体复合物I，降低ATP，升高AMP，来激活AMPK，抑制糖异生，降低血浆游离脂肪酸，增加胰岛素分泌；通过增加肌肉中GLUT4 的转位，促进葡萄糖的摄取；通过上调线粒体中PGC-1α 的基因表达，增加胰岛素敏感性，来降低血糖［17-20］。

DM 中医学称之为消渴，主要病机为气阴两虚、燥热内盛，由于热伤气阴，致使热毒浊邪聚生，瘀阻血络，火热邪气是DM 的基本致病因素和重要病理机制［21-23］，因此，本研究确立了清热、化瘀、解毒的治法。大黄黄连泻心汤中大黄能够清热泻火、凉血解毒、逐瘀通经，黄连、黄芩能够清热燥湿、泻火解毒。本课题组在前期的临床中应用大黄黄连泻心汤治疗T2DM，发现患者口干多饮、多食、四肢麻木等症状减轻，血糖、血脂明显降低，具有较好的临床疗效［24］。本研究采用高糖高脂饲料联合小剂量STZ 法构建T2DM 大鼠模型，造模后所有大鼠的FPG 均显著高于空白对照组，说明造模成功，证明此方法制备T2DM 大鼠模型可行。模型组大鼠胰岛β 细胞数量减少，细胞透明样变，FPG、TC、TG、LDL-C 明显高于空白对照组，经大黄黄连泻心汤治疗后，大鼠胰岛β 细胞数量有所增加，细胞变性程度较轻，空泡细胞减少，检测FPG、TC、TG、LDL-C 显著降低，说明大黄黄连泻心汤能够降低血糖、血脂，对胰岛β 细胞具有修复和保护作用，与课题组前期的临床观察一致，证实了大黄黄连泻心汤对糖脂代谢的调节作用。中药组与二甲双胍组比较，FPG、TC、TG、LDL-C 无显著差异，说明大黄黄连泻心汤降糖、降脂疗效确切，为临床应用提供了实验依据。

本实验研究结果显示，发生DM 时，骨骼肌中AMPKα、PGC-1α、GLUT4 的mRNA 及蛋白表达量减少，P-AMPKα/AMPKα 比值降低，说明骨骼肌细胞中AMPK 磷酸化受到抑制，AMPKα 活性显著降低，抑制了GLUT4、PGC-1α 表达，使葡萄糖转运受阻，出现胰岛素调节障碍，血糖升高，这可能是外周组织出现胰岛素抵抗的原因之一。本实验应用大黄黄连泻心汤治疗后，骨骼肌中P-AMPKα、AMPKα、PGC-1α、GLUT4的mRNA 及蛋白表达量增加，P-AMPKα/AMPKα 比值增高，与二甲双胍组比较，结果一致，提示大黄黄连泻心汤对糖脂代谢的调节作用与二甲双胍一致，也与AMPK 信号通路相关，也是通过提高AMPK 磷酸化水平，激活AMPK，上调PGC-1α 和GLUT4 的表达，来降低血糖，这是其降糖、降脂作用机制的一个方面，AMPK 信号通路并不是大黄黄连泻心汤调节血糖代谢的唯一通路，发现其可能作用的其他信号通路并明确作用靶点，还有待于进一步研究。AMPKα 与GLUT4、PGC-1α 这两个因子并不是完全独立的，而是彼此联系。AMPKα 可诱导PGC-1α、GLUT4 基因表达，PGC-1α 又可以调控GLUT4 的表达量，三者协同作用，使骨骼肌细胞转运葡萄糖的能力提高。本实验中应用大黄黄连泻心汤治疗后，RT-PCR 和Western blot 的结果趋势一致，AMPKα、GLUT4、PGC-1α 表达量均增加，说明基因表达量的变化，经转录、翻译，引起了蛋白表达量相应的变化。

综上所述，大黄黄连泻心汤在T2DM 大鼠模型中应用，降糖、降脂效果明显，对胰岛β 细胞具有修复和保护作用，其降糖机制与AMPK 信号通路相关，通过激活AMPKα，增加PGC-1α、GLUT4 的表达，进而调节糖脂代谢。本实验为大黄黄连泻心汤的临床应用提供了理论依据，它可能作为AMPK 信号通路的激活剂，为T2DM 的预防和治疗提供新思路。