正交试验和Box-Behnken设计-响应面法优化五味子炮制工艺比较

刘炬灼，何 凡*，孙小玲

(1.辽宁中医药大学 药学院，辽宁 大连 116600；2.辽宁省药品检验检测院，辽宁 沈阳 110031)

五味子是木兰科植物五味子SchisandraeChinensis(Turcz.)Baill.的干燥成熟果实，具有收敛固涩、益气生津、补肾宁心的功效，用于久嗽虚喘、梦遗滑精、遗尿尿频、久泻不止、自汗盗汗、津伤口渴、内热消渴、心悸失眠等病症的治疗[1]，是临床上生熟异用的代表药之一。通过对五味子的传统和现代文献的查阅得知，五味子“入嗽药生用，入补药熟用”[2]，熟药中产生作用的主要是木脂素类成分，炮制后，木脂素类成分普遍增加。在五味子中，木脂素类成分所占比例最高，因此本研究将木脂素类成分作为评价五味子炮制工艺优劣的检测指标，进一步优化五味子的炮制工艺。

1 仪器与材料

1.1 试验药物

五味子药材购于辽宁光太药业有限公司(生产许可证号：辽20150117，批号：20180301)；对照品五味子醇甲(批号：1116A023，纯度≥98%)、五味子醇乙(批号：327A021，纯度≥98%)、五味子甲素(批号：327B021，纯度≥98%)、五味子乙素(批号：405A022，纯度≥98%)、五味子丙素(批号：327A021，纯度≥98%)、五味子酯甲(批号：327B021，纯度≥98%)均购自北京索莱宝科技有限公司；五味子酯乙(批号：P07M6S1，纯度≥98%)、五味子酚(批号：B21324，纯度≥98%)均购自上海源叶生物科技有限公司。

1.2 试剂

甲醇、乙腈(色谱纯，天津科密欧化学试剂有限公司)；水为娃哈哈纯净水。

1.3 仪器

1200型高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；超声波清洗机(型号：JP-040S，深圳市洁盟清洗设备有限公司)；50克手提式高速万能粉碎机(型号：DFT-50，温岭市林大机械有限公司)；AR2140电子分析天平(上海奥豪斯公司)。

1.4 辅料

9°米醋(总酸度≥9.00 g/100 mL，江苏恒顺醋业股份有限公司)；陈酿黄酒(镇江恒顺酒业有限责任公司)。

2 方法与结果

2.1 木脂素类成分含量测定方法

2.1.1 色谱条件 Agela C18柱(博纳艾杰尔科技有限公司，4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相为乙腈(A)-水(B)，梯度洗脱，0～10 min，A：20%～55%；10～30 min，A：55%；30～40 min，A：55%～75%；40～50 min，A：75%～80%；VWD检测器，检测波长：217 nm；柱温：30 ℃；流速为1.0 mL/min；进样量：10 μL。

2.1.2 对照品溶液制备 取五味子各对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含五味子醇甲39.20 μg、五味子醇乙9.35 μg、五味子酯甲2.81 μg、五味子酯乙6.36 μg、五味子酚2.50 μg、五味子甲素16.31 μg、五味子乙素23.60 μg、五味子丙素3.47 μg的混合对照品溶液，经0.45 μm微孔滤膜滤过，即得。

2.1.3 供试品溶液制备 取本品粉末(过三号筛)约0.25 g，精密称定，置于25 mL量瓶中，加甲醇约20 mL，超声处理(功率200 W，频率40 kHz)20 min，取出，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.1.4 方法学考察

2.1.4.1 线性关系考察 精密吸取混合对照品溶液3、5、10、12、15、20 μL测定各色谱峰峰面积。以对照品进样量为横坐标(X)，色谱峰峰面积为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，计算回归方程。结果见表1。

表1 8种成分的回归方程及线性范围

2.1.4.2 精密度试验 取同一供试品溶液，精密吸取10 μL，分别重复进样6次，测定并记录峰面积，计算总木脂素含量，结果总木脂素含量的RSD小于2%，表明仪器精密度良好。

2.1.4.3 稳定性试验 取同一供试品溶液，分别于0、2、4、6、12、24 h进样10 μL，测定并记录峰面积，计算总木脂素含量，结果总木脂素的RSD小于2%，表明总木脂素在24 h内稳定。

2.1.4.4 重复性试验 取同一批样品6份，分别按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，分别进样10 μL，在“2.1.1”项色谱条件下测定并记录峰面积，计算总木脂素含量，结果总木脂素含量的RSD小于2%，表明该方法重复性良好。

2.1.4.5 加样回收率试验 采用加样回收率的方法，取同一批样品6份，精密称定0.125 0 g，分别精密加入8种对照品溶液。按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1.1”项色谱条件下测定峰面积，计算回收率，结果表明8种木脂素平均加样回收率为95%～102%，RSD小于2%，说明该方法准确度良好。

2.2 正交设计和BBD-RSM优选五味子酒蒸和醋蒸炮制工艺

2.2.1 炮制方法 酒、醋蒸五味子：取净五味子10 g，用黄酒或米醋拌匀，置于适宜容器内，闷润，隔水蒸制，表面显紫黑色时取出，50 ℃烘11 h[3]。

2.2.2 试验设计 参考文献方法[4]，选用辅料用量(A)、闷润时间(B)、蒸制时间(C)作为考察因素，每个因素选择3个水平，以8种木脂素含量的总和为指标，采用L9(34)正交表进行试验设计；BBD-RSM利用Design-Expert 8.0.6软件进行试验设计。

2.2.3 实验结果

2.2.3.1 正交试验结果 结果表明，各因素对实验结果的影响程度为A>B>C；方差分析结果表明，三种因素对酒制炮制工艺均没有显著影响(P>0.05)，最佳的酒制炮制工艺为A1B3C2，20(g/100 g)黄酒，闷润2 h，蒸制时间为3 h取出，烘干。

表2 优选五味子酒制工艺的正交试验因素水平设计

表3 优选五味子醋制工艺的正交试验因素水平设计

结果表明，各因素对实验结果的影响程度为A>C>B；方差分析结果表明，因素A和因素C对炮制工艺有显著影响，因素B没有显著影响，最佳的炮制工艺为A2B2C3，30 g/100 g米醋，闷润1.5 h，蒸制5 h取出，烘干。

2.2.3.2 BBD-RSM试验结果

表4 BBD-RSM优选五味子酒制工艺的因素水平及实验结果

续表4 BBD-RSM优选五味子酒制工艺的因素水平及实验结果

各因素经回归拟合后，得二次多项回归方程为Y=-18.228 84+1.504 93A+23.397 10B-2.564 58C-0.622 61AB+0.412 19AC-0.497 15BC-0.035 437A2-1.483 45B2-0.924 56C2。通过方差分析模型具有显著性；失拟项不显著；多元相关系数R2=0.995 5，说明相关性越好；RAdj2=0.987 5和RPred2=0.944 5(RAdj2-RPred2<0.2)这两个值高且接近，则回归模型能充分说明工艺过程。C.V.%=1.32%<10%，表明实验的可信度和精确度高；Adeq Precision=37.959(精密度)>4，视为合理。所以拟合的回归方程符合以上检验原则，适应性较好。此外，因素B、因素C、AB、AC的P<0.05，具有显著性，各因素的影响大小依次为C>B>A。利用 Design-Expert 8.0.6软件，根据拟合模型绘制三维曲线图，见图1、图2、图3，了解各因素的交互作用对总木脂素的影响。AB、AC交互作用显著，BC交互作用不显著。

图1 酒的用量(A)与闷润时间(B)的交互作用

图2 酒的用量(A)与蒸制时间(C)的交互作用

图3 闷润时间(B)与蒸制时间(C)的交互作用

表5 BBD-RSM优选五味子醋制工艺的因素水平及实验结果

各因素经回归拟合后，得二次多项回归方程为Y=-43.29+1.101 23A+18.305 85B+16.982 82C+0.165 21AB-0.004 287 5AC-3.485 2BC-0.022 338A2-3.649 52B2-1.365 25C2。通过方差分析模型具有显著性；失拟项不显著；R2=0.992 8；RAdj2=0.979 8和RPred2=0.895 3(RAdj2-RPred2<0.2)；C.V.%=1.44%<10%；Adeq Precision=25.978>4。所以拟合的回归方程符合以上检验原则，适应性较好。此外，因素B、因素C、AB、BC的P<0.05，具有显著性，各因素的影响大小依次为B>C>A。利用 Design-Expert 8.0.6软件，根据拟合模型绘制三维曲线图，见图4、图5、图6。结果表明，AB、BC交互作用较显著，AC交互作用不显著。

图4 醋的用量(A)与闷润时间(B)的交互作用

图5 闷润时间(B)与蒸制时间(C)的交互作用

图6 醋的用量(A)与蒸制时间(C)的交互作用

2.2.3.3 验证实验

表6 验证实验结果

3 讨论

BBD-RSM采用多元二次回归方程拟合自变量与响应值之间的函数关系，在对回归方程进行求解来找出最优工艺参数的方法，可借助软件Design-expert，获得更多信息。正交设计以拉丁方的正交性为依据，进行有选择的试验，在解决多变量问题上应用更久更广泛，便于获得最优的因素组合和最佳试验结果[5-6]。其中五味子酒制工艺，正交试验结果显示没有显著性因素，只能大概看出各因素对试验结果的影响趋势；而BBD-RSM找出了具有显著性的因素：闷润时间、蒸制时间，且找出显著性的交互作用：酒的用量与闷润时间、酒的用量与蒸制时间。两种设计方法最终所得总木脂素含量相接近，且正交试验中所得最佳工艺辅料用量和蒸制时间比BBD-RSM少，为节约成本，提高产量，故五味子酒制工艺最佳工艺为酒的用量20 g/100 g，闷润时间2 h，蒸制时间3 h。关于五味子醋制工艺，BBD-RSM比正交试验得到的总木脂素含量高，且闷润时间少了30 min，为提高产量，节约时间，故五味子醋制工艺最佳工艺为醋的用量30 g/100 g，闷润时间1 h，蒸制时间5 h。