独活寄生汤含药血清对大鼠退变软骨细胞TLR4/NF-κB信号通路的影响

吴广文，邱建清，刘淑如，陈 俊

(1.福建中医药大学 中西医结合研究院，福建 福州 350122；2.福建省中西医结合老年性疾病重点实验室，福建 福州 350122；3.福建中医药大学 中西医结合学院，福建 福州 350122)

膝骨关节炎(knee osteoarthritis，KOA)是影响中老年人生活质量的常见病，目前KOA发病机制尚未完全明确，现代医学从组织形态学、生物化学及分子生物学等方面对其发病机制展开研究，认为KOA是在力学和生物学等因素共同作用下导致软骨细胞、细胞外基质及软骨下骨三者降解和合成正常偶联失衡的结果[1]。炎症反应介导的软骨细胞凋亡、软骨基质降解是引起KOA软骨退变的关键因素，在KOA病理过程中发挥重要作用[2]。前期研究发现TLR4/NF-κB信号通路异常激活将引起下游效应产物炎症因子过表达，在关节炎发病过程中具有重要作用[3-8]，中医药可有效调节TLR4/NF-κB信号通路表达[9-10]。

独活寄生汤出自孙思邈《备急千金要方》，广泛用于KOA的治疗，疗效可靠[11-16]。前期研究表明，独活寄生汤可有效延缓软骨退变[17-23]，但是否通过调节TLR4/NF-κB信号通路，尚不明确。因此，研究以SD大鼠退变软骨细胞为研究平台，通过观察独活寄生汤含药血清对TLR4/NF-κB信号通路的影响，探讨独活寄生汤治疗KOA的作用机制，为其临床应用提供依据。

1 材料与试剂

1.1 实验动物

2月龄SPF级雄性SD大鼠36只，4周龄SPF级SD大鼠20只(购于上海斯莱克实验动物有限责任公司，合格证号：SCXK(沪)2017-0005)。

1.2 主要试剂与仪器

一抗TLR4、MyD88和TRAF6(美国abcam公司)；一抗NF-κB p65(美国cell signaling公司)；二抗(美国Millipore公司)；诱导型一氧化氮合酶(iNOS)检测试剂盒、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)检测试剂盒、白介素-6(IL-6)检测试剂盒(武汉云克隆科技股份有限公司)；TLR4、MyD88、TRAF6、NF-κB p65引物(福州尚亚生物技术有限公司)；酶标仪(Thermo Fisher Scientific公司)；蛋白核酸分析仪(美国Beckman Coulter公司)；ABI 7500实时荧光定量PCR仪(美国Applied Biosystems公司)。

2 方法

2.1 血清制备

将36只SD大鼠随机分为含药血清组和空白血清组，每组18只。根据药理试验中动物与人体间的等效剂量换算关系[24]，含药血清组按照9.3 g·kg-1给予独活寄生汤灌胃，空白血清组给予等量生理盐水灌胃，每天1次。连续灌胃7 d，10%水合氯醛麻醉后行腹主动脉采血，离心获取独活寄生汤含药血清和空白血清，56 ℃水浴灭活30 min，-20 ℃保存备用。

2.2 退变软骨细胞造模及药物干预

参照课题组前期取材方法，采用10%水合氯醛腹腔麻醉后，颈椎脱臼处死大鼠，75%酒精浸泡5 min，游离并截取膝关节，置入无菌培养皿，带入超净工作台操作。先用PBS充分漂洗，刮除关节周围附着的肌肉、脂肪、骨膜、滑膜等组织后再次用PBS充分漂洗。用刀片削取每个关节表面的软骨，PBS充分漂洗3次，采用酶消化法消化，获取软骨细胞[25]。培养、传代至第3代，用10 ng·mL-1IL-1β干预24 h，获得退变软骨细胞[26-27]。将退变软骨细胞分为两组：模型组(参照以往研究结果[17]，用含10%空白血清的培养基干预)和治疗组(参照以往研究结果[17]，用含10%独活寄生汤含药血清的培养基干预)，干预24 h后进行相关指标检测。

2.3 ELISA检测各组iNOS、TNF-α和 IL-6含量

干预结束后，吸取细胞培养液上清，保存于离心管中。消化、收集细胞，加入保存的细胞培养液上清，重悬细胞，1 000 g离心5 min，弃上清。PBS洗涤细胞2次。加入PBS重悬细胞，超声处理细胞悬液。-20 ℃反复冻融3～5次。4 ℃，1 000 g离心5 min，取上清。参照试剂盒说明书测定各组样品iNOS、TNF-α和 IL-6含量。

2.4 Real-time PCR法检测各组细胞中TLR4、MyD88、TRAF6和NF-κB p65 mRNA表达

干预结束后，采用Trizol法提取各组细胞总RNA；核酸分析仪检测各样本RNA浓度(μg/μL)和OD260/280值。根据TAKARA逆转录试剂盒说明书，取1 μg总RNA逆转录成cDNA，逆转录条件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃。以1 μL·cDNA为模板扩增TLR4、MyD88、TRAF6、NF-κB p65和GAPDH。扩增反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40个循环；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。以GAPDH为内参照基因，计算各目的基因2-ΔΔCt，比较分析各目的基因mRNA表达水平。目的基因引物序列见表1。

表1 目的基因引物序列

2.5 Western blot法检测各组细胞中TLR4、MyD88、TRAF6和NF-κB p65蛋白表达

干预结束后，提取各组总蛋白，BCA法测定蛋白浓度后，每孔按照30 μg上样，SDS-PAGE凝胶电泳；采用湿转转膜；室温封闭1 h后；一抗(TLR4，1∶1 000；MyD88，1∶1 000；TRAF6，1∶1 000；NF-κB p65，1∶1 000；β-actin，1∶2 000)，4 ℃孵育过夜；次日分别用羊抗兔或抗小鼠抗体室温孵育1 h；参照ECL化学发光试剂盒说明书，凝胶成像仪下显影、拍照。

2.6 统计学分析

3 结果

3.1 独活寄生汤含药血清对iNOS、TNF-α和 IL-6水平的影响

与模型组相比，治疗组iNOS、TNF-α和IL-6含量均降低，差异具有统计学意义(P<0.01)。见图1。

注：与模型组比较，*P<0.01，**P<0.05。

3.2 独活寄生汤含药血清对TLR4、MyD88、TRAF6和NF-κB p65 mRNA表达的影响

与模型组相比，治疗组中TLR4表达降低到(0.648±0.064)，MyD88表达降低到(0.692±0.051)，TRAF6表达降低到(0.612±0.010 5)，NF-κB p65表达降低到(0.734 2±0.084 8)，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2。

注：与模型组比较，*P<0.01；**P<0.05。

3.3 独活寄生汤含药血清对TLR4、MyD88、TRAF6和NF-κB p65蛋白表达的影响

独活寄生汤含药血清对退变软骨细胞TLR4、MyD88、TRAF6和NF-κB p65蛋白表达的影响与其对TLR4、MyD88、TRAF6和NF-κB p65 mRNA的影响具有类似的趋势。与模型组相比，治疗组中TLR4、MyD88、TRAF6和NF-κB p65蛋白表达均降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见图3。

注：与模型组比较，*P<0.01；**P<0.05。

4 讨论

骨关节炎(osteoarthritis，OA)是一种多见于中老年人的骨关节疾病，发病率随年龄增长而增加[28]，其病程特点是易反复发作、缠绵难愈，具有较高的致残率，严重影响患者的生活质量[29]，治疗方法虽多，但主要以对症治疗为主，其防治已成为医学界研究的难点问题之一。软骨退变是OA最主要的病理变化，是多因素综合作用的结果。软骨细胞是软骨中的唯一细胞，分散于细胞外基质中，对维持软骨的完整性以及软骨的负重功能具有重要作用。在OA中，炎症因子会通过细胞内的信号转导途径将信号传递给各种转录因子，从而介导软骨细胞的分化，诱导软骨细胞表型变为成纤维细胞表型，促使关节中的软骨细胞凋亡，周围组织纤维化[30]。因此，如何有效抑制炎症反应对软骨的破坏，将成为治疗OA的重要途径。本研究检测了退变软骨细胞中炎症相关因子iNOS、TNF-α和IL-6含量，结果发现经过独活寄生汤含药血清干预后，iNOS、TNF-α和IL-6含量均降低，提示独活寄生汤含药血清可通过有效抑制退变软骨细胞中iNOS、TNF-α和IL-6含量，抑制OA炎症反应，最终达到缓解OA之目的。

NF-κB是一种与炎症因子产生、细胞增殖、细胞外基质交联和细胞凋亡密切相关的转录因子，参与多种炎症的信号转导[31]，在细胞中最常见的作用形式为NF-κB p65及NF-κB p50。未受刺激时结合在一个或几个抑制性的κB蛋白(IκB)上，形成NF-κB/IκB复合物，以非活化形式存在。IκB不仅阻止NF-κB的核内转录，也阻止其在胞质与核内的穿梭。IκB的活性又被IκB激酶(IκB kinases，IKK)控制。当细胞受到促炎因子等刺激，会激活IKK使IκB磷酸化，IκB磷酸化后发生泛素化，引起IκB水解，释放NF-κB，进一步调节NF-κB依赖的基因表达[32]，如iNOS、TNF-α、IL-6和IL-8等，进而对细胞损伤、炎症等起到一定的促进作用。本研究采用Real-time PCR方法，从基因层面检测退变软骨细胞中NF-κB p65 mRNA表达，结果发现经过独活寄生汤含药血清干预后NF-κB p65 mRNA表达量明显下降。进一步采用Western blot方法，从蛋白层面检测退变软骨细胞中NF-κB p65蛋白表达，发现独活寄生汤含药血清干预后NF-κB p65蛋白表达量明显下降，与NF-κB p65基因变化趋势一致。基于以上研究结果，考虑独活寄生汤含药血清可能是通过调节NF-κB信号通路，进而调节iNOS、TNF-α和IL-6表达，但NF-κB信号通路是否是唯一通路，需要后期进一步研究证实。

TLR的亚型TLR4是重要的信号通路转导蛋白，它与OA发病机制密切相关，高表达于OA软骨细胞中，参与软骨破坏[33-34]。TLR4能够识别病原相关分子模式PAMP及其他辅助受体结合形成的受体复合物信号转导，可诱发炎性因子表达，引发炎性反应[35]。TLR4信号通路可分为MyD88依赖性信号通路和MyD88非依赖性信号通路[36]。TLR4结构域与MyD88的同源结构域相结合，活化MyD88，进而引起IRAK的自磷酸化[37]，磷酸化的IRAK与肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)相互作用形成复合物，促使NIK活化，进而活化IKK，降解IκB，并释放转录因子NF-κB(如NF-κB p65)，由胞质转位到核内，刺激各种细胞因子等的表达[38-40]。本研究采用Real-time PCR方法，从基因层面检测退变软骨细胞中TLR4、MyD88、TRAF6 mRNA表达，发现经过独活寄生汤含药血清干预后TLR4、MyD88、TRAF6 mRNA表达量均明显下降。进一步采用Western blot方法，从蛋白层面检测退变软骨细胞中TLR4、MyD88、TRAF6蛋白表达，发现独活寄生汤含药血清干预后TLR4、MyD88、TRAF6蛋白表达量均明显下降。基于以上研究结果，考虑独活寄生汤含药血清可能是通过调节TLR4、MyD88、TRAF6，进而调控NF-κB信号通路表达，但其是否是唯一途径，需要后期进一步研究验证。

5 结论

独活寄生汤可能是通过调控TLR4/NF-κB信号通路，进而调节炎症相关因子iNOS、TNF-α和IL-6表达，起到治疗骨关节炎的作用。