耐镉芽孢杆菌对Cd2+的吸附机制

余雪梅 彭书明 王洪婷 伏媛 李璟 张山

摘要：从攀枝花矿区淤泥样品中通过逐级提高Cd2+浓度进行驯化，获得1株高耐镉菌株PFYN01，经16S rDNA PCR鉴定为芽孢杆菌（Bacillus sp），最大耐Cd2+浓度为3 900 mg/L。研究初始Cd2+浓度、pH值、菌量对菌株吸附Cd2+的影响，利用扫描电镜（SEM）和傅叶里红外光谱（FTIR）探究菌株吸附机制。结果表明，PFYN01在初始Cd2+浓度为75 mg/L、菌量为1.0 g/L、pH值为5.0时，对Cd2+的吸附率达到34.98%;吸附符合Langmuir模型，最大吸附量为 1.974 mg/g。对比分析Cd2+吸附前后的细胞形态和红外光谱变化，证实了“细胞成分羟基（O—H）、酰胺基（N—H）、烃基（C—H）、羧基（C[FY=，1]O）、羰基（—COOH）参与了Cd2+与PFYN01的相互作用”的结论。PFYN01是一株对Cd2+有较强吸附能力的细菌菌株，对其吸附Cd2+影响因素及吸附机制研究的结果将为重金属污染微生物修复提供指导。

关键词：镉污染;耐镉细菌;驯化;生物吸附;吸附机理

中图分类号：X703.1 文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2019）20-0293-05

随着工业的发展，尤其是采矿、冶炼、工业活动的大肆开展，越来越多重金属通过不同途径进入到土壤或水体环境中，对生态环境和人体健康产生严重威胁[1-2]。镉是一种毒性很强的重金属，可降低酶活性，引起DNA断裂、细胞氧化损伤[3-4]。由于镉具有难迁移、难降解和生物累积等特点，如何有效治理重金属镉污染问题已成为目前国内外研究热点之一[5-6]。

微生物是生态系统中营养物质循环的关键，尤其可以在各种极端的pH值、温度甚至有毒金属条件下生存和生长，部分微生物群已对重金属形成了一定的耐性和抗性。研究表明，从市政废水中分离出能够耐受1 000 mg/L Cd2+的芽孢杆菌，并对其他重金属Cr6+、Ni2+、Co2+也有一定抗性[7];从韩国重金属污染土壤中分离出1株能够耐镉浓度为200 mg/L的芽孢杆菌（Bacillus sp.）菌株，该菌株也对其他单一重金属Pb、Cu、Ni、Mn、Cr、Co、Zn和混合重金属有较高的吸附性[8]。通过UV照射获得枯草芽孢杆菌的突变种，该菌株能够耐受的镉浓度为337.23 mg/L，对其他重金属Cr、Hg、Pb的耐受浓度分别为208、100、932.4 mg/L，而野生型枯草芽孢杆菌只能耐受的镉浓度为28 mg/L[9]。从重金属镉污染土壤中筛选出1株能在镉浓度为200 mg/L的固体培养基上生长的蜡状芽孢杆菌，具有较高的抗性能力[10]。然而，这些报道的芽孢杆菌属对Cd2+耐受和抗性浓度主要集中在1 000 mg/L以下，而对其他有较高耐受的芽孢杆菌属的报道较少。

考虑到从矿堆的淤泥中筛选的微生物有很高的耐受性，可能存在多重吸附机制以及许多微生物能够同时降解或吸附多种污染物，有助于高效降低矿堆重金属浓度[11-12]。因此，本研究从渣场堆淤泥中分离出1株高耐镉细菌菌株，研究影响菌株吸附Cd2+的最佳条件，通过扫描电镜观察Cd2+在吸附过程中微观形貌的变化，利用红外光谱，通过官能团吸收峰值的变化和位移，分析Cd2+存在时细胞壁表面化学基团的变化情况，以期对Cd2+的吸附行为有一个更加清晰的认识。本研究可为寻找具有高选择性和高吸附能力的吸附剂提供理论依据，为微生物在镉污染治理中的应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以四川攀枝花巴关河西渣场堆渣区旁池塘淤泥为试验样品，随机选取3个样方，每个样方面积约1 m2。在每个样方中随机采集适量淤泥，淤泥样品采集完后立即密封保存，储存于实验室4 ℃冰箱。

LB液体培养基：蛋白胨10 g，酵母浸膏粉5 g，NaCl 10 g，加纯水至1 L，pH值调至5.5～5.7，121 ℃高压灭菌20 min。LB固体培养基须要另加入1.5%琼脂，121 ℃高压灭菌20 min。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株驯化

从攀枝花矿渣淤泥样品中吸取2 mL上清液加入到50 mL液體培养基中，对耐受性菌种进行分离纯化。将筛选出的菌株接种至液体培养基上，置于30 ℃、120 r/min恒温摇床上培养;5 d后吸取0.5～2 mL培养物在新配制的液体培养基中接种，恒温摇床培养继续5 d，记录其生长曲线。

1.2.2 菌株抗镉能力

重复“1.2.1”节接种驯化3～4次，对驯化后的菌液采用稀释涂布平板法，取菌液并稀释成10-3和10-4的稀释液各100 μL，分别在含Cd2+浓度为10、30、60、100、200、400、800、…、3 600 mg/L的平板上涂布培养。不同镉浓度梯度各做1组平行，采用同样方法将菌液稀释液涂布于固体平板上进行培养，记录生长情况及菌落形态等。

1.3 耐镉菌株吸附Cd2+的条件分析

挑取单菌落到LB液体培养基中，30 ℃、120 r/min条件下培养至对数期（16～24 h）;6 000 r/min离心7 min，弃上清，称其菌体鲜质量;将所收集菌体制成定量菌悬液。

将100 μL菌悬液接种到20 mL含有不同浓度Cd2+的培养基中，在设置的各参数下吸附，6 000 r/min离心7 min，取上清，用原子吸收分光光度法测定Cd2+浓度（每个浓度做3个平行），每组均以不加菌体组为对照，按以下公式计算菌体对Cd2+的吸附率A（%）：

式中：C1为吸附前溶液中的Cd2+质量浓度，mg/L;C2为吸附后溶液中的Cd2+质量浓度，mg/L。

1.3.1 不同的Cd2+浓度、时间、pH值、菌量对吸附的影响

每个影响因素均设置3组平行试验，为测定吸附平衡最佳时间，调节Cd2+浓度为75 mg/L、菌量为1.0 g/L，pH值为5.5，于30 ℃、130 r/min恒温培养箱中振荡培养，分别于0、2、4、…、16、24、32、48 h取样。为测定Cd2+浓度对吸附效果的影响，Cd2+浓度分别为10、25、50、75、100、125、150 mg/L，调节菌量为1.0 g/L、pH值为5.5，于30 ℃、130 r/min恒溫培养箱中振荡培养8 h，吸附平衡后取样。为了确保菌量对吸附效果的影响，菌量分别为0.01、0.1、0.5、1.0、2.0 g/L，调节Cd2+浓度为75 mg/L、pH值为5.5，于30 ℃、130 r/min恒温培养箱中振荡培养8 h，吸附平衡后取样。为了测定pH值对吸附效果的影响，pH值分别调节为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，调节菌量为1.0 g/L、Cd2+浓度为75 mg/L，于30 ℃、130 r/min恒温培养箱中振荡培养8 h，吸附平衡后取样。

1.3.2 等温吸附模型

分别采用Langmuir和Freundlich吸附等温式模拟吸附过程[13-14]。Langmuir模型中，吸附量qe与平衡时Cd2+浓度Ce的双倒数成直线关系，模型如下：

Langmuir方程式中b的值能反映吸附能力以及不同生物量大小的吸附率。

Freundlich模型中，qe平衡时重金属浓度Ce的双对数成直线关系[13-14]。Freundlich吸附方程为：

式中：KF和n均为Freundlich吸附模型的吸附常数。

1.3.3 菌株Cd2+吸附机制分析

用扫描电镜（SEM）分析观察，分别设置不添加Cd2+（对照）和添加20、300 mg/L Cd2+的2个处理，并按上述处理配制相应的LB液体培养基。将培养液以2%接种量分别接种到上述培养基中，30 ℃、130 r/min振荡培养24 h，将菌液分别用蒸馏水洗涤3遍。菌株细胞通过2.5%戊二醛固定、乙醇浓度梯度脱水、干燥和喷金等操作后，使用扫描电镜观察细胞表面形态。

菌株PFYN01分别于Cd2+浓度为0、75 mg/L的液体培养基中培养24 h，6 000 r/min离心7 min收集菌体，用蒸馏水清洗3次，70 ℃烘干至恒质量，按1 ∶100比例取菌体和烘干的KBr粉末混匀，在玛瑙研钵中充分研磨，压片制样后红外光谱仪测定。

1.4 数据处理与分析

采用Excel 2016处理试验数据并进行误差分析;采用Origin 9.0对数据进行拟合。

2 结果与分析

2.1 菌落形态观察及生长情况

2.1.1 耐镉菌株的驯化

采用微生物纯培养方法从攀枝花巴关河西渣场矿区淤泥样本中筛选出一批耐性菌株，通过逐级提高Cd2+浓度的方法驯化获得1株高耐镉菌株PFYN01。PFYN01能够在Cd2+浓度为100 mg/L的LB培养基中生长，进行传代培养18代后仍能在3 600 mg/L Cd2+的LB固体培养基中生长，表明该菌株不但镉的耐受浓度高，且耐镉的遗传稳定性好。在Cd2+浓度为3 900 mg/L时，菌株生长很少，结果表明PFYN01菌株对Cd2+有较强的耐受性。

2.1.2 菌落形态观察

PFYN01菌体生长较快，在LB培养基中培养1 d左右，菌落形态近似圆形，表面光滑湿润，边缘不整齐，质地软，乳白色，色素不扩散，较黏稠，易挑起（图1）。该菌株能使淀粉水解，不能水解油脂和明胶，糖类发酵试验中显阳性。其生理生化特点与芽孢杆菌相似，16S rDNA序列同源性比较发现，PFYN01的16S rDNA与芽孢杆菌（Bacillus sp.） L25亲缘关系较近，同源性为99%。因此，可初步断定PFYN01为芽孢杆菌（Bacillus sp.）。

2.1.3 不同初始浓度下PFYN01的生长情况

图2为初始Cd2+质量浓度分别在0、50、100、200、400 mg/L下培养48 h后的PFYN01生长曲线图。当镉浓度为0时，PFYN01菌株 1 h 左右进入对数生长期，大约24 h后进入稳定期。当镉浓度为50 mg/L时，延长了对数期且生长量较低;当镉浓度超过50 mg/L[CM（22*5]时，重金属Cd2+对菌株的生长有明显的抑制作用。

但菌株能够在含镉（100 mg/L以下）的液体培养基中正常生长，表明该菌株对Cd2+有耐受性。

2.2 耐镉菌株吸附条件研究

2.2.1 初始Cd2+质量浓度

由图3可知，当Cd2+浓度为 10～25 mg/L时，菌株PFYN01对Cd2+的吸附率随浓度的增加而缓慢升高，在Cd2+浓度相对较低的环境中，吸附Cd2+可能以胞内吸附结合为主[15];当Cd2+浓度为50～75 mg/L时，菌株PFYN01对Cd2+的吸附率迅速增高，在Cd2+浓度为 75 mg/L 时达到最大值，为34.98%。说明在一定初始Cd2+质量浓度范围内，随着Cd2+浓度增加有利于菌株对其的吸附，可能是因为细菌与Cd2+在胞内结合，使得Cd2+与菌株有效碰撞的概率增高、吸附位点增加，同时胞外吸附也起一定的作用;当Cd2+浓度超过75 mg/L时，随着Cd2+浓度增加，吸附率降低，可能是因为高浓度的Cd2+会抑制微生物的生长代谢，使其结构发生变化，相应也会导致微生物表面吸附位点减少，从而减少其表面吸附量[12]。

2.2.2 pH值

一般而言，pH值是影响溶液中重金属含量和吸附剂吸附能力的重要因素之一，它会影响吸附剂的表面电荷、官能团质子化程度[16]。本研究的pH值范围为4.0～8.0，结果如图4所示，随着pH值的升高，Cd2+吸附率呈先上升后下降的趋势，pH值为5.0时，Cd2+的吸附率达到最高，为33.98%。在pH值较低时，溶液中存在大量的H3O+，占据菌体细胞壁的吸附活性位点，活性基团被质子化，从而增加了细胞表面的静电斥力，阻碍离子交换作用[12]。当pH值达到 5.0～7.0时，重金属离子形态发生改变，导致吸附量减少，吸附率依次降低。

2.2.3 菌量

由图5可知，随着接种量从0.01 g/L增加到 2.0 g/L 的加入，菌株对Cd2+的吸附率从6.26%增加到 34.79%，吸附率在接种量为1.0 g/L时达到最高，可能是随着接种量的增加，细菌量增多，提供吸附位点也相应增加，总的生物吸附量也就变多，但吸附率并不完全随着接种量的增加而升高;当PFYN01的接种量从1.0 g/L增加到2.0 g/L時，其对Cd2+的吸附率为34.12%，说明此时细菌表面吸附位点达到饱和，当接种量超过1.0 g/L时，再继续增加，吸附率增加不明显[6]。因此，为了提高吸附率并节约成本，接种量不宜过大。

2.2.4 耐镉菌株吸附Cd2+的等温模型

为了考察在最佳条件下PFYN01对Cd2+的吸附能力、最大吸附量与溶液中Cd2+浓度之间的平衡关系，采用的是Langmuir和Freundlich 2种模型来拟合吸附试验结果，模拟结果见图6，相关参数见表1。Langmuir方程的决定系数R2=0.927，较Freundlich方程的R2高，吸附温度为30 ℃，Cd2+浓度为75 mg/L时，能达到平衡参数。通过计算，芽孢杆菌PFYN01对Cd2+的理论最大吸附力量为qmax=1.974 mg/g，与实际测得的1.902 mg/g相接近。因此可以判定Langmuir更适合描述菌对Cd2+的等温吸附过程，说明生长菌体PFYN01对Cd2+吸附过程是一个单分子层吸附、吸附剂表面均匀。

2.3 扫描电镜分析

扫描电镜能从不同角度对样品细胞表面微观形态进行观察，对在空白对照（0）、低浓度（20 mg/L）和高浓度（300 mg/L）的Cd2+进行吸附后的细菌扫描，观察细胞的变化，分析Cd2+对细胞的影响，并推测作用机制。

由图7可知，PFYN01为革兰氏阳性长杆菌，菌株在 0 mg/L Cd2+浓度下，细胞结构完整，表面光滑饱满;在20 mg/L Cd2+浓度下，细胞结构完整，但表面出现大量褶皱，无细胞破碎，有些细胞出现大小不等的空泡，细胞内可能发生变性反应，这说明一定浓度的Cd2+会给细胞带来损伤，使细菌出现凋亡特征;在300 mg/L Cd2+浓度下，PFYN01细胞表面褶皱更加明显，部分细胞穿孔现象，胞内物质表面有细小颗粒堆积在细胞表面，表明胞内物质完全流失并与Cd2+形成络合物，推测是由于Cd2+浓度过高，胞内外渗透压差距较大，更多高毒性的Cd2+进入到细胞内部，胞内物质迅速从孔中溢出。

2.4 菌株PFYN01吸附前后红外光谱图及分析结果

将吸附Cd2+前后菌株样品进行红外光谱检测，光谱图如图8所示，在500～4 000 cm-1波数内均有吸收峰。根据文献[17]对谱带进行归属，菌体主要成分是碳水化合物和蛋白质。其中，3 330.3 cm-1附近的吸收带是分子间氢键O—H和N—H的伸缩振动，吸收峰强而宽，Kim等研究发现，蜡状芽孢杆菌从3 200～3 600 cm-1的宽带和强带可能由胺的羟基（O—H）和氨基（N—H）的重叠造成的;吸收峰是—COOH中的 O—H和C—H;1 785.67、1 697 cm-1处的吸收峰主要来自蛋白酰胺Ⅰ带或脂类化合物的C[FY=，1]O伸缩振动[18]。Sun等的研究发现，地衣芽孢杆菌在波数为1 734 cm-1的吸收峰处，呈现出羰基（C[FY=，1]O）和酰胺基（[FY=，1]CO—、CO—NH）的变化;1 585 cm-1处的吸收峰来自蛋白质酰胺Ⅱ带（N—H弯曲与C—N伸缩振动）吸收峰[19]。Fang等研究发现，苏云金芽孢杆菌在 1 653、1 540 cm-1附近的主要谱带归属于酰胺Ⅰ和酰胺Ⅱ，酰胺Ⅱ可能是细胞壁的重要组分之一;1 284、1 298 cm-1处吸收峰主要来自蛋白酰胺Ⅲ带C—N伸缩振动吸收，N—H变形振动相当于—CH2的剪式振动方式[20]。陈永华等研究发现，蜡样芽孢杆菌在波数位于1 280.97～1 305.42 cm-1之间是典型脂碳链C—H伸展振动吸收带[21-22]。吸附后与对照组的红外光谱图相比，在 3 330.3 cm-1 处的吸收峰强，在初始浓度为 75 mg/L的Cd2+作用下波数偏移到3 286 cm-1，说明来自多聚糖、蛋白质和脂肪酸组分的O—H和N—H参与了Cd2+吸附过程;在 1 785.67、1 697 cm-1处吸附后波数偏移到1 737、1 656.8 cm-1，强度有所下降，表明酰胺Ⅰ带的C[FY=，1]O键伸缩振动参与了Cd2+的吸附。FIRT分析表明，细胞参与镉吸附的官能团主要有酰胺基（N—H）、羧基（COOH）、羟基（O—H）、烃基（C—H）、羰基（C[FY=，1]O）。

3 结论

本研究从攀枝花矿渣淤泥中分离筛选获得一批耐性菌株，通过逐级提高Cd2+浓度，驯化出1株在液体培养基、固体培养基中分别能够耐受700、3 900 mg/L Cd2+的革兰氏阳性细菌，经鉴定为芽孢杆菌（Bacillus sp.），命名为PFYN01;芽孢杆菌菌株PFYN01对Cd2+耐受和抗性浓度相比其他报道的芽孢杆菌属高。

菌株PFYN01对Cd2+有较好的吸附效果，在Cd2+初始浓度为75 mg/L、投菌量为1.0 g/L、pH值5.0时，对Cd2+的吸附率可达到34.98%。运用吸附等温模型拟合菌株吸附Cd2+过程，发现菌株PFYN01符合Langmuir模型，最大吸附量为1.974 mg/g，表明菌株PFYN01在吸附过程中是单分子层吸附，属于物理吸附。

菌株SEM检测发现PFYN01为长杆状，Cd2+浓度在0～300 mg/L之间，PFYN01可生长繁殖。Cd2+浓度超过 20 mg/L 时，菌体部分细胞发生形变，细胞质严重收缩，胞内物质释放，随着Cd2+浓度增加对PFYN01抑制作用增强。

通过FTIR分析PFYN01表面官能团对Cd2+的螯合作用，结果表明，菌株PFYN01表面与Cd2+结合的官能团有—OH、 N—H、C—H和C[FY=，1]O等，其中—OH和C[FY=，1]O是优先吸附点。此外，在高浓度Cd2+吸附过程中，酰胺Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ谱带发生了明显的变化，表明在高浓度下，蛋白质中酰胺基可能起着重要的作用，其次可能是脂类或糖类物质。

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