不同单株大叶女贞对冬季低温的生理响应

高树涛 李文彬 郭绍霞 李伟

摘要：为探索冬季大叶女贞枝条防御性酶活性的变化规律及其与植株抗寒性的关系，以不同抗寒等级植株枝条为材料，测定枝条水分含量、苯丙氨酸解氨酶活性、多酚氧化酶活性、抗坏血酸过氧化物酶活性、过氧化氢酶活性、相对电导率、丙二醛含量、可溶性蛋白含量和可溶性糖含量等各项指标。结果表明：不同受冻等级的大叶女贞枝条苯丙氨酸解氨酶活性、多酚氧化酶活性、抗坏血酸过氧化物酶活性、过氧化氢酶活性、可溶性蛋白含量、可溶性糖含量与植株抗寒性呈正相关，自由水与束缚水比值、丙二醛含量、相对电导率与植株抗寒性呈负相关。大叶女贞冬季枝条防御性酶活性以及可溶性蛋白含量、可溶性糖含量反映出的抗寒性与植株实际的受冻情况基本一致。不同受冻等级之间的抗寒性差异，是由于其在低温胁迫下的生理活性调节能力不同所致，这种生理调节能力和植株的遗传性有关。

关键词：大叶女贞;冬季低温;生理响应;自由水;束缚水;苯丙氨酸解氨酶;多酚氧化酶;抗坏血酸过氧化物酶;过氧化氢酶;相对电导率;丙二醛;可溶性蛋白;可溶性糖

中图分类号： S687.101 文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2019）20-0168-04

近年来，由于全球气候多变，极端天气频发，温带气候区的木本植物在自然周年生长过程中经常遭受环境低温胁迫的威胁[1-2]，甚至出现因冷害导致植物死亡的现象[3]。低温伤害每年都给全世界农林生产造成巨大损失。研究表明，植物受低温冷害时，体内的细胞膜透性、渗透调节系统及代谢过程等一系列生理过程都会发生显著的变化[4-5]。5种酢浆草属植物经过自然低温处理，结合形态特征观测，测定相对电导率、丙二醛含量、可溶性蛋白含量等指标，评价其抗寒性，结果表明在自然低温处理下，5种植物的生理生化指标变化趋势基本一致，与自然低温处理下的观测结果[6]一致。王娜等研究八角金盘、夹竹桃、阔叶十大功勞、樟叶槭4种常绿植物的抗寒性表明，在低温下植物体的可溶性糖含量、游离脯氨酸含量、过氧化物酶活性和相对电导率整体呈上升趋势[7]。也有研究表明，低温可以诱导黄瓜幼苗叶片中苯丙氨酸解氨酶的基因表达。叶片中相对电解质渗漏率和丙二醛含量显著升高，提高了胞内抗氧化酶（过氧化氢酶、抗坏血酸过氧化物酶）活性，可有效地清除活性氧分子，维持抗氧化物质抗坏血酸（AsA）氧化还原状态，缓解低温引起的光损伤和氧化损伤[8]。

大叶女贞（Ligustrun lucidum）别称蜡树，又名女贞、高杆女贞、冬青等，为木樨科女贞属常绿阔叶乔木，原产亚热带地区[4]。中国栽培以长江以南及西南地区为主，甘肃南部与华北南部少有栽培;其叶片光洁亮绿，经冬不落，是南方园林绿化中的主要树种之一。随着中国北方城市园林绿化的发展，大叶女贞已引种到北京、上海、青岛等地。然而我国绝大部分北方地区冬季寒冷，大叶女贞常表现较严重的冻害，影响其观赏价值和经济价值。选育出适合北方发展优良抗寒品种，安全越冬已成为推广大叶女贞在北方地区生产栽培发展中的重要制约因素。

本试验通过对青岛农业大学校园内栽植的大叶女贞冬季受冻情况进行全面调查并分级，初选出部分优良抗寒单株。而表型选择通常会受到环境因子的影响，为确定初选的耐寒植株、正常植株及受冻严重的植株之间在生理水平上是否有差异，笔者通过不同抗寒性植株枝条水分含量以及防御性酶活性的变化，进一步在生理水平上对筛选出的耐寒植株进行评定，以期为培育大叶女贞优良抗寒品系提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试大叶女贞枝条采自青岛农业大学校园。青岛农业大学位于120°12′E、36°20′N，属暖温带季风大陆性气候，年均气温12.6 ℃，1月最低，月平均气温-2 ℃，8月最高，月平均气温25.7 ℃，年平均降水量700 mm左右。

1.2 试验方法

大叶女贞受冻调查等级试验于2018年3月1日至4月14日在青岛农业大学菌根生物技术研究所进行。调查方法为实地普查记录受冻害植物的受害程度以及具体表现，同时为了便于比较分析，本研究在参考相关研究资料[9-11]的基础上，以综合所调查植物总体受冻害状况的特点为依据，制定了冻害分级标准，具体见表1。

随机选择不同受害等级的植株3株，随机剪取1年生发育枝10根，并迅速在剪切口封蜡，装入塑封袋封好。带回实验室后，迅速用刀分离1年生枝条的韧皮部与木质部。把韧皮部分8份，分装后，放入-20 ℃的低温冰箱内备用。

1.3 测定指标

1.3.1 大叶女贞枝条总含水量测定 取任一称量瓶并称质量（m1）;取相同大小的枝条3根，立即装入称量瓶中，盖紧瓶盖并精确称质量（m2）;再将称量瓶连同枝条放入烘箱中105 ℃ 杀青，其间敞开瓶盖，于85 ℃下烘至恒质量后称质量（m3）。质量差等于叶片含水量，以上测定重复3次，总含水量计算公式如下：

植物组织的总含水量=（m2-m3）/（m2-m1）×100%。

1.3.2 大叶女贞枝条自由水含量的测定 任取一称量瓶并称质量（m4），取相同大小的枝条3根，立即装入称量瓶中，盖紧瓶盖并称质量（m5），再在称量瓶中加入5 mL蔗糖（浓度为C1），再分别称质量（m6）。把称量瓶放置于暗处6 h，其间不时轻轻摇动，到预定的时间后充分摇动溶液，分别测定各瓶蔗糖的浓度（C2），以上测定重复3次，具体计算公式如下：

植物组织中自由水的含量=（m6-m5）×（C1-C2）/[（m5-m4）×C2]×100%;

束缚水=总含水量-自由水含量。

1.3.3 防御性酶活性的测定 苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性的测定参照紫外分光光度计法[12];抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性测定参照Xia等的方法[13];过氧化氢酶（CAT）活性的测定采用紫外线吸收法;可溶性蛋白含量采用考马斯亮蓝G-250法;相对电导率测定采用电导率法;丙二醛（MDA）含量的测定采用硫代巴比妥酸比色法;多酚氧化酶（PPO）活性、可溶性糖含量参考王学奎的方法[14]测定。

1.4 数据分析

采用Microsoft Excel软件进行数据统计和绘图，采用DPSv 7.5分析软件进行方差分析，采用Duncan's法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 不同单株大叶女贞叶片冬季自由水和束缚水含量

自由水与束缚水的含量与抗寒性紧密相关。自由水直接参与细胞各种代谢活动，当自由水含量升高时，代谢的活性升高，生长发育较快;当束缚水的含量升高时，细胞内的原生质变成凝胶状态，植物的代谢活性减弱，生长缓慢。自由水与束缚水的比值可以用来评价植株的抗寒性。由表2可见，在同一低温胁迫下，6个大叶女贞受冻等级枝条中自由水与束缚水比值差异明显，0级大叶女贞自由水与束缚水比值最小，为1.42，Ⅴ级比值最大，为3.85。植物抗寒性与自由水与束缚水比值呈负相关，大叶女贞不同枝条抗寒性的顺序为0级>Ⅰ级>Ⅱ级>Ⅲ级>Ⅳ级>Ⅴ级。

2.2 不同单株大叶女贞叶片冬季PAL和PPO活性

苯丙氨酸解氨酶（PAL）催化L-苯丙氨酸解氨生成反式肉桂酸，是苯丙烷类次生代谢途径的限速酶和关键酶，与植物的非生物逆境抗性密切相关。在同一低温胁迫下，6个大叶女贞受冻等级枝条中PAL活性差异显著。Ⅱ级大叶女贞PAL 活性最高 为20.4 U/mg Ⅴ级活性最低 为7.6 U/mg。

植物抗寒性与PAL活性呈正相关，大叶女贞不同枝条抗寒性的顺序为Ⅱ级>0级>Ⅰ级>Ⅲ级>Ⅳ级>Ⅴ级（图1）。

多酚氧化酶（PPO）广泛存在于植物体的各种器官或组织中，是植物抗寒性的基础条件之一。在同一低温胁迫下，6个大叶女贞受冻等级枝条中PPO活性差异显著。0级大叶女貞枝条PPO活性最高，为170 U/g，Ⅴ级活性最低，为 86.3 U/g，植物抗寒性与PPO活性呈正相关，抗寒性的顺序为0级>Ⅰ级>Ⅲ级>Ⅱ级>Ⅳ级>Ⅴ级（图1）。

2.3 不同单株大叶女贞叶片冬季APX和CAT活性

植物通过调节自身一系列的代谢反应对低温胁迫作出适应性响应，维持细胞膜稳定性和胞内渗透平衡，其中APX能够积累抗氧化物质抗坏血酸（AsA）含量，保护细胞免受伤害。在同一低温胁迫下，6个大叶女贞受冻等级枝条中APX活性差异显著。Ⅰ级大叶女贞APX活性最高，为216 U/g，Ⅴ级活性最低，为135.4 U/g。植物抗寒性与APX活性呈正相关，抗寒性的顺序为Ⅰ级>Ⅱ级>Ⅲ级>零级>Ⅳ级>Ⅴ级（图2）。

同时，植物离体后还会产生较多的抗氧化酶及其他非酶类抗氧化剂来提高适应性，以抵御活性氧氧化损伤及致死效应。其中，CAT可以将过氧化氢分解成水，可清除体内具有潜在危害的 O-2·和H2O2，这样可避免羟自由基对细胞的破坏。在同一低温胁迫下，6个大叶女贞受冻等级枝条中CAT活性差异显著。0级大叶女贞CAT活性最高，为5.4 U/g，Ⅴ级活性最低，为2.2 U/g。植物抗寒性与CAT活性呈正相关，抗寒性的顺序为0级>Ⅰ级>Ⅲ级>Ⅱ级>Ⅳ级>Ⅴ级（图2）。

2.4 不同单株大叶女贞叶片冬季可溶性蛋白和可溶性糖含量

在低温条件下可溶性蛋白含量提高是植物对低温的适应性反应。可溶性蛋白对未经抗寒锻炼的原生质膜有保护作用，其机制可能是增加了质膜中蛋白质之间的亲和力，从而增强了膜结构在冰融过程中的稳定性。在同一低温胁迫下，6个大叶女贞受冻等级枝条中可溶性蛋白含量差异显著。0级大叶女贞可溶性蛋白含量最高，为7.4 mg/g，Ⅴ级含量最低，为3.7 mg/g。抗寒性与可溶性蛋白含量呈正相关，抗寒性的顺序为0级>Ⅰ级>Ⅱ级>Ⅳ级>Ⅲ级>Ⅴ级（图3）。

在低温条件下植物体内的可溶性糖不断积累，其主要是作为渗透调节物质和防脱水剂起作用，可以降低细胞的水势并增强其持水力。在同一低温胁迫下，6个大叶女贞受冻等级枝条中可溶性糖含量差异显著。Ⅱ级大叶女贞可溶性糖含量最高，为0.86 mg/g，Ⅴ级含量最低，为0.34 mg/g。植物抗寒性与可溶性糖含量呈正相关，抗寒性的顺序为Ⅱ级> 0级>Ⅰ级>Ⅲ级>Ⅳ级>Ⅴ级（图3）。

2.5 不同单株大叶女贞叶片冬季MDA含量和相对电导率

膜脂过氧化加剧所导致的细胞膜透性增加和细胞渗透压变化，是导致植株耐寒性强弱的依据;而MDA是膜脂过氧化的产物，细胞渗透压变化影响植物相对电导率，MDA含量直接反映膜脂过氧化损伤程度。在同一低温胁迫下，6个大叶女贞受冻等级枝条中MDA含量和相对电导率差异显著。Ⅰ级大叶女贞MDA含量和相对电导率最低，分别为 4.5 mg/g 和43%，Ⅴ级活性最高，分别为10.4 mg/g和73%。植物抗寒性与MDA含量呈负相关，抗寒性的顺序为Ⅰ级<0级<Ⅱ级<Ⅲ级<Ⅳ级<Ⅴ级;与相对电导率也呈负相关，抗寒性顺序为Ⅰ级<0级<Ⅲ级<Ⅱ级<Ⅳ级<Ⅴ级（图4）。

2.6 各单项指标相关系数矩阵

本研究对6个大叶女贞受冻等级处理及9个指标进行相关分析，得到相关系数矩阵（表3）。由表3可以看出，大叶女贞枝条PAL活性与PPO活性呈显著正相关，与可溶性糖含量呈极显著正相关。大叶女贞枝条自由水和束缚水比值与PAL活性、PPO活性、APX活性、CAT活性、可溶性蛋白含量和可溶性糖含量呈负相关，与MDA含量、相对电导率呈正相关。

3 结论与讨论

植物的生长发育以及对不良环境胁迫的响应是一个多因素控制的复杂过程。许多研究证实，当植株受到低温环境影响后，植物体内自由水和束缚水含量、CAT活性、MDA含量、相对电导率、APX活性、PAL活性、PPO活性、可溶性蛋白含量，可溶性糖含量往往会发生较大幅度的变化，这表明均与植物的抗寒性有密切关系[15-16]。

植物體内的水分含量及状态在一定程度上决定植物的抗寒性[17]，自由水含量高、束缚水含量低的植物抗寒性差。自由水在低温状态下易结冰，导致细胞脱水死亡或者在细胞内部形成冰晶损伤细胞膜系统，造成植物抗寒性下降;而束缚水通常在-20～-25 ℃下保持不结冰。本研究结果表明，受害情况较轻的0级和Ⅰ级枝条总含水量和束缚水含量较高，自由水含量较低，表现出较强的耐寒性。植物叶片细胞膜的稳定性与其抗寒性密切相关。当植物受到冻害时，体内活性氧含量会增多，膜脂过氧化反应产生的MDA会增多，同时叶片细胞膜的结构受到不同程度的破坏，膜透性增强，细胞内的部分电解质外渗，引起代谢紊乱，植物的生长发育受到阻碍，甚至死亡。研究细胞膜透性、MDA含量与抗寒性的相关性发现，细胞膜的稳定性与抗寒性呈正相关，MDA含量与抗寒性呈负相关，证明细胞膜透性和MDA含量是衡量植物抗寒性的有效指标[5]。本试验结果表明，受害情况较轻的0级和Ⅰ级枝条内MDA含量以及细胞膜透性较小，冻害程度较大的Ⅴ级枝条中MDA含量、细胞膜透性最大，表明外观冻害程度较大的大叶女贞枝条与生理上的反应基本一致，这与林艳等的研究结果[18]相符合。

同时，植物受低温后还会产生较多的抗氧化酶（PAL、PPO、APX、CAT等）及其他非酶类抗氧化剂来提高适应性，以抵御活性氧氧化损伤及致死效应[19-20]。抗氧化酶类可以将过氧化氢分解成水，相互之间共同作用可清除体内具有潜在危害的 O-2·和H2O2，这样可避免羟自由基对细胞的破坏。本试验中受害情况较轻的0级和Ⅰ级枝条PAL活性、PPO活性、APX活性以及CAT活性等较高，具有较强的耐寒性，表明抗氧化酶类可以在一定程度上表现出大叶女贞的抗寒性，酶活性越强，植株抗寒性越强。植物遭受低温后，所伴随的生理生化变化包括蛋白质、糖等大分子营养物质和结构物质逐渐降解[21-23]。其中，可溶性蛋白、可溶性糖含量是表现植物抗寒性的重要指标，本研究结果表明0级大叶女贞枝条可溶性蛋白含量最高，Ⅱ级可溶性糖含量次之，这可能是由环境因素引起的，其具体原因还须进一步试验证实。

综上所述，大叶女贞不同个体植株表现出的不同抗寒性的差异，在其枝条自由水与束缚水含量、防御性酶活性及可溶性蛋白和可溶性糖含量的变化上呈现出不同的变化趋势，与其在外观表型上变化基本一致。

参考文献：

[1]华梦艺，顾卓雅，殷甘强，等. 低温胁迫下蒙古黄芪差异表达基因分析[J]. 植物生理学报，2017（4）：581-590.

[2]Alvarez-Uria P，Koerner C. Low temperature limits of root growth in deciduous and evergreen temperate tree species[J]. Functional Ecology，2007，21（2）：211-218.

[3]Fukuda A，Yamatani S，Kobata T，et al. Decrease of leaf water potential and leaf injury of tea plant（Thea sinensis L.）subject to cold winter wind in sanin region of Japan. Ⅰ. Response of leaf water potential and leaf injury under field conditions[J]. Japanese Journal of Crop Science，2008，62（2）：188-192.

[4]Lei T，Nishikawa N，Yamashita N. Park pruning prompts a competitive reversal of an exotic tree，Ligustrum lucidum，in urban forests of Japan[J]. Urban Ecosystems，2016，19（3）：1-16.

[5]陈禹兴，付连双，王晓楠，等. 低温胁迫对冬小麦恢复生长后植株细胞膜透性和丙二醛含量的影响[J]. 东北农业大学学报，2010，41（10）：10-16.

[6]李文明，魏一粟，钱燕萍，等. 5种酢浆草属植物对低温胁迫的生理响应及抗寒性评价[J]. 东北林业大学学报，2017，45（7）：28-33.

[7]王 娜，王奎玲，刘庆华，等. 四种常绿阔叶树种的抗寒性[J]. 应用生态学报，2016，27（10）：3114-3122.

[8]董春娟，李 亮，曹 宁，等. 苯丙氨酸解氨酶在诱导黄瓜幼苗抗寒性中的作用[J]. 应用生态学报，2015，26（7）：2041-2049.

[9]宋 杰，李树发，陆 琳，等. 2013—2014年冬春昆明主要园林植物冻害调查分析[J]. 西南林业大学学报，2015（3）：102-106.

[10]唐 岱，杜 娟，孙晓佳. 昆明主城区2016年冬季园林植物冻害情况调查分析与建议[J]. 中国园林，2017，33（4）：87-91.

[11]杨晓东，赵永祥，林卫东，等. 云南师范大学校园植物受冻害调查与植物合理配置分析[J]. 林业调查规划，2014（1）：79-82.

[12]Shang Q M，Li L，Dong C J. Multiple tandem duplication of the phenylalanine ammonia-lyase genes in Cucumis sativus L.[J]. Planta，2012，236（4）：1093-1105.

[13]Xia X J，Wang Y J，Zhou Y H，et al. Reactive oxygen species are involved in brassinosteroid-induced stress tolerance in cucumber[J]. Plant Physiology，2009，150（2）：801-814.

[14]王学奎. 植物生理生化试验原理和技术[M]. 2版.北京：高等教育出版社，2006：190-192.

[15]Li J，Yan X F，Zu Y G. Generation of activated oxygen and change of cell defense enzyme activity in leaves of Korean pine seedling under low temperature[J]. Acta Botanica Sinica，2000，42（2）：148-152.

[16]李玉舒，邹原东. 低温胁迫对木槿电导率和抗氧化酶活性的影响[J]. 黑龙江农业科学，2016（9）：82-85.

[17]Lu J H，Zhang M，Xie J，et al. Changes of membrane permeability and protective enzyme activity in cucumber fruit during low temperature stress[J]. Guangdong Agricultural Sciences，2012，22：153-156.

[18]娄晓鸣，吕文涛，张文婧. 景天属植物抗寒性调查及抗寒生理指标[J]. 江苏农业科学，2012，40（3）：150-151.

[19]林 艳，郭伟珍，徐振华，等. 大叶女贞抗寒性及冬季叶片丙二醛和可溶性糖含量的变化[J]. 中国农学通报，2012，28（25）：68-72.

[20]姜艳娟. 西双版纳雾凉季低温对3种热带植物光合作用和抗氧化酶活性的影响[J]. 西北植物学报，2008，28（8）：1675-1682.

[21]杜秀敏，殷文璇，赵彦修，等. 植物中活性氧的产生及清除机制[J]. 生物工程学报，2001，17（2）：121-125.

[22]刘 波，郑国生，闫志佩，等. 低温处理对牡丹春节催花及营养类物质变化的影响[J]. 西北植物学报，2004，24（9）：1635-1639.

[23]张莉梅，张子晗，喻方圆. 低溫层积过程中野鸦椿种子生理生化变化的研究[J]. 中南林业科技大学学报，2016，36（11）：36-40.