外源一氧化氮处理对山茶抗寒性的影响

周琳 杨柳燕 潘琦 张斌 房婉萍 朱旭君 张永春

摘要：以花鹤翎、六角大红茶花为材料，以硝普钠（SNP）为外源一氧化氮（NO）供体，研究外源NO对低温胁迫条件下山茶花生理特性的影响。结果表明，在正常生长条件下，外源NO对2个山茶花品种的叶绿素、可溶性糖、可溶性蛋白、游离脯氨酸（Pro）含量以及 O-2·生成速率影响不显著，但对超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和过氧化物酶（POD）的活性略有提高。低温胁迫下，2个山茶花品種的叶绿素含量降低，可溶性糖、可溶性蛋白、Pro、过氧化氢（H2O2）、丙二醛（MDA）含量以及 O-2·生成速率显著增加，SOD、CAT、POD活性显著提高。低温胁迫下，外源NO处理显著减少了H2O2和膜脂过氧化物产物MDA的积累，显著提高了叶绿素、可溶性糖、可溶性蛋白含量以及SOD、CAT、POD活性。低温胁迫下，外源NO可通过提高山茶可溶性物质含量以及抗氧化酶活性，降低H2O2和MDA的积累，从而保护细胞膜结构的稳定性，最终减轻冷害胁迫对山茶花的伤害，增强其抗冷性。

关键词：山茶;一氧化氮;生理生化;抗寒性

中图分类号： S685.140.1 文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2019）20-0142-06

山茶花（Camellia japonica L.）属山茶科山茶属，主要分布于我国西南和南部温暖地区。山茶具有叶色浓绿、常年不凋，花色花型多样丰富等优点，是我国的十大传统名花之一，也是世界驰名花卉。目前茶花栽培品种已达万余个，在英、美、日、意、法等国家都有栽培和培育，成为各国不可或缺的庭院观赏花木，具有较高的经济价值。山茶花喜温暖湿润气候，适宜温度在20～25 ℃之间，在炎热和寒冷地区其长势较差，当温度高于35 ℃则会引起叶片灼伤、花芽分化受阻、落蕾落花，严重时甚至导致干枯死亡[1]。虽然山茶大部分品种可耐-8 ℃低温，淮河以南地区多数可自然越冬，但大多数山茶在北方地区不能安全越冬。因此，耐热性和耐寒性是其应用推广的重要基础研究。目前，山茶耐热性研究已引起了研究者的重视[2-3]，而耐寒性研究目前主要集中于山茶属经济作物茶树上[4]，因此研究低温胁迫下山茶的生理生化，提高山茶抗寒性具有重要意义，且对于丰富北方冬季园林景观具有十分重要的价值。

一氧化氮（nitric oxide）作为易透膜且化学性质活跃的生物小分子，除了参与种子萌发、叶片伸展、根系生长、花芽分化、枝条抽生、花粉管生长、气孔关闭以及细胞程序性死亡，还广泛参与非生物胁迫下的信号传导，在低温胁迫、干旱胁迫、高温胁迫、盐胁迫、重金属胁迫等非生物胁迫中作为信号分子起着重要作用[5]。外源NO在植物非生物胁迫中的作用已受到植物界的普遍关注，已有研究表明，施用外源NO可提高拟南芥、番茄、小麦、玉米、南瓜等植物的抗寒性[6-9]。随着研究的深入，发现外源NO可通过上调抗氧化酶基因、Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶基因（P5CS1）和脯氨酸脱氢酶基因（ProDH）等渗透调节物质相关基因的表达，从而提高抗氧化酶活性以及渗透调节物质含量，减轻低温胁迫对植物的伤害，并且提高植物抗寒性[8，10-11]。

山茶花品种花鹤翎花型漂亮、树型美观、病虫害少且管理养护较为简单，喜温暖环境，其花期可从2月持续至5月，具有园林绿化应用前景;山茶花品种六角大红为大红色，基本为完全重瓣型，花期可从12月中下旬持续至4月初，花朵初放至凋谢期间，花瓣始终保持挺拔，无后翻和明显褪色现象，即使低温环境下，花瓣边缘仍保持不焦枯。因此，本试验针对山茶在我国北方冬季难以安全越冬问题，以花色艳丽、树形美观、具有园林绿化开发应用前景的茶花品种花鹤翎和六角大红为试验材料，研究外源施加NO对低温胁迫下山茶生理特性的影响，探讨外源NO对提高山茶抗冷性的作用，以期为北方地区山茶花有效防御冬季低温冷害提供理论依据和技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

选用浙江省金华市扦插繁殖2年生花鹤翎和六角大红茶花，各150株。试验于2017年4月在上海市农业科学院玻璃温室和人工气候箱中进行，昼夜温度为25 ℃/20 ℃，光周期为12 h/12 h，相对湿度为75%～80%，所有山茶花在玻璃温室中培养1个月用于后期研究。

试验使用的NO供体为硝普钠[Na2Fe（CN）5]，购自于Sigma公司，纯度为98.5%，并用蒸馏水配制成5 mmol/L的母液，4 ℃保存，试验时按所需浓度进行稀释。

1.2 试验设计

培养1个月后对2个品种的山茶花进行试验处理。外源喷施SNP溶液和纯水，均为对山茶苗叶片均匀喷雾，直至有水滴落下为止。试验分为以下处理：（1）T1：喷施100 μmol/L SNP溶液，常温处理;（2）T2：喷施纯水后，0 ℃人工气候箱低温处理;（3）T3：喷施处理100 μmol/L SNP溶液，0 ℃人工气候箱低温处理。分别处理0、4、8、12、24、48 h时取山茶叶片，擦去叶片表面灰尘，称质量后放入液氮速冻，- 80 ℃冰箱保存。

1.3 测定指标及测定方法

叶绿素含量测定参照李合生的方法[12];采用蒽酮比色法测定可溶性糖含量[13];采用考马斯亮蓝法测定可溶性蛋白含量[14];采用酸性茚三酮显色法测定游离脯氨酸（Pro）含量[15];超氧阴离子自由基（O-2·）产生速率测定参照王爱国等的方法[16];采用刘俊等方法测定H2O2含量[17];采用硫代巴比妥酸法测定丙二醛（MDA）含量[18];采用NBT（氮蓝四唑）法测定超氧化物歧化酶（SOD）活性[19];采用紫外吸收法测定过氧化氢酶（CAT）活性[20];采用愈创木酚法测定过氧化物酶（POD）活性[21]。以上所有指标均重复测定3次。

1.4 数据统计分析

试验数据用软件Excel 2010进行统计和SPSS 20.0进行分析，采用Duncan's新复极差法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 外源NO对低温胁迫下山茶叶片叶绿素含量的影响

叶绿素是绿色植物进行光合作用的主要色素，对光能的吸收、传递和转化起着极其重要的作用，因此叶绿素的含量与组成同植物光合作用有着密切的关系。外源NO处理下，山茶叶片叶绿素含量变化见表1。常温下，外源SNP处理（T1处理）花鹤翎叶绿素含量不同处理时间之间不显著，六角大红在处理后的4 h时含量提高至3.48 mg/g，在12 h时下降至3.25 mg/g，24、48 h时升高至3.34、3.41 mg/g。在低温胁迫下（T2处理），花鹤翎和六角大红在4～48 h期间其叶绿素含量均显著下降。花鹤翎和六角大红在喷施SNP后，低温胁迫处理下（T3处理），虽然叶绿素含量在4～48 h期间均显著降低，但其含量均高于同时期的T2处理。此外，在T2、T3处理下，六角大红叶绿素含量均高于同时期的花鹤翎。说明施加外源NO能够增加低温胁迫下山茶叶片的叶绿素含量，提高光合作用和生长。

2.2 外源NO对低温胁迫下山茶叶片可溶性糖、可溶性蛋白和游离脯氨酸含量的影响

可溶性糖、可溶性蛋白和游离脯氨酸是植物细胞器渗透调节作用的重要物質。从表2可见，正常生长下喷施SNP（T1）对2个山茶花叶片的可溶性糖、可溶性蛋白和游离脯氨酸含量无明显影响。低温胁迫下，2个山茶品种在4 h时可溶性糖、可溶性蛋白和游离脯氨酸含量已显著提高（P<0.05），且随着胁迫时间的延长而显著增加。低温胁迫下，喷施SNP处理（T3）2个山茶品种的可溶性糖、可溶性蛋白和游离脯氨酸含量在4～48 h期间显著增加，且其含量始终高于同时期的低温处理（T2）。低温胁迫下（T2、T3处理），六角大红的可溶性糖、可溶性蛋白和游离脯氨酸含量始终高于花鹤翎。表明外源NO能提高山茶叶片中可溶性糖、可溶性蛋白和游离脯氨酸含量，从而提细胞液浓度，降低质膜受冻害的程度，从而缓解低温对山茶造成的伤害。

2.3 外源NO对低温胁迫下山茶叶片O-2·生成速率和H2O2、MDA含量的影响

超氧阴离子自由基（O-2·）是分子氧单电子还原产生的阴离子自由基，在植物体内其不断地产生也不断被清除，而在逆境胁迫下，则导致其迅速积累[22]。常温下，O-2·在外源NO处理下，其生成速率在0.37～0.40 nmol/（g·min）间浮动且差异不显著。低温胁迫下（T2），花鹤翎和六角大红的生成速率则在4 h时已分别显著提高至0.55、0.64 nmol/（g·min）;花鹤翎随着低温胁迫时间的延长，在48 h时已达 0.93 nmol/（g·min），而六角大红则在4～24 h期间保持在0.65 nmol/（g·min）以下，在48 h时仅为 0.70 nmol/（g·min）。T3处理下，花鹤翎和六角大红的 O-2·生成速率虽然随着低温胁迫时间的延长而显著增加，但在4、12、24、48 h时均显著低于同时期的T2处理（表3）。表明外源NO处理可减少山茶花叶片中O-2·积累。

低温胁迫会引发H2O2的大量产生，过量的H2O2得不到及时清除，则会对植物造成毒害作用。丙二醛含量的变化反映着环境胁迫下细胞内氧自由基积累导致的脂膜过氧化程度，其含量越高表明植物受逆境胁迫伤害程度越大。正常生长条件下，花鹤翎和六角大红在外源NO处理下，H2O2和丙二醛含量虽然分别在0.17～0.23 μmol/g、1.04～1.27 nmol/g之间浮动变化，但其含量始终都显著处于较低水平，且显著低于低温胁迫时的含量。低温胁迫下，2个山茶品种H2O2、丙二醛含量随着胁迫时间的延长而显著增加，在48 h时，花鹤翎和六角大红的H2O2含量分别达到了0.82、0.70 μmol/g;丙二醛含量分别达到6.11、5.50 nmol/g。外源NO处理（T3）的2个山茶品种虽然变化趋势和T2处理一致，但在处理期间H2O2和丙二醛含量均低于同时期的T2处理（表4）。表明常温下外源NO虽然会引起山茶H2O2和丙二醛含量的变化，但并未对其造成伤害;而低温胁迫下，外源NO处理能有效减少H2O2的大量产生，降低膜脂过氧化程度。

2.4 外源NO对低温胁迫下山茶叶片抗氧化酶活性的影响

超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）是植物保护酶系统中的重要3种酶，在清除生物自由基上担负着重要功能。SOD能将O-2·转化为H2O2，而CAT和POD可将H2O2进一步清除产生H2O，三者协同作用可使自由基维持在一个较低水平，从而避免膜伤害，达到保护细胞的目的。由表5可知，正常生长条件下喷施SNP（T1）提高了山茶的SOD、CAT、POD活性，即使处理达48 h时，花鹤翎的酶活性分别为109.17、99.08、925.33 U/g，六角大红的酶活性分别为114.18、160.12、952.00 U/g，均显著高于0 h时的酶活性。2个品种的山茶在低温胁迫下（T2），SOD、CAT、POD活性都显著，在48 h时花鹤翎酶活性比0 h相比提高了73.54%、59.12%、52.45%，六角大红则分别提高了168.77%、192.34%、53.03%。外源NO处理下（T3），SOD、CAT、POD活性随着低温胁迫时间的延长而显著增强，且其活性始终高于同时期的T2处理。说明随着低温胁迫时间的延长，山茶细胞内 O-2·和H2O2含量已超出正常水平（表3、表4），触发了细胞内抗氧化酶活性增强，其活性显著上升表明低温胁迫下其清除自由基的能力增强，从而缓解细胞内多余的自由基对细胞的伤害。同时，表明外源NO能有效提高SOD、CAT和POD的活性，以减轻低温胁迫对山茶的伤害作用。

3 讨论

3.1 外源NO对山茶叶片叶绿素含量的影响

植物光合作用中叶绿素在光能吸收、传递和转化过程中起着重要作用，因此叶绿素含量是反映植物光合作用能力的一个间接指标[23]。研究结果表明，叶绿体对低温敏感性较强，低温处理下植物叶绿体发生膨胀变形、类囊体片层结构紊乱、叶绿体膜出现内吞现象等，伴随着叶绿素含量降低，最终导致光合速率下降[24]。外源NO能提高低温处理下一年生黑麦草[25]、棉花[11]、玉米[26]等植株叶片中叶绿素含量，本试验的研究结果与之一致。此外，外源NO在盐胁迫下能维持八宝景天光化学活性[27]，缓解盐胁迫和高温胁迫下水稻叶片叶绿素的降解[28]。非生物胁迫下，NO以浓度依赖的方式与活性氧（ROS）清除酶类共同作用应对抗氧化胁迫，或者直接作为抗氧化剂清除ROS[29]。这可能是因为外源NO可提高抗氧化酶活性，清除低温胁迫产生的部分ROS，促进了低温胁迫下山茶类囊体膜蛋白复合体的组装和稳定，缓解了叶绿素的分解，保持叶绿体对光能的吸收和利用，从而促进了光合作用。

3.2 外源NO对山茶叶片可溶性物质含量的影响

植物对低温胁迫的响应除了基因表达、膜组成变化、激素合成、抗氧化酶活性变化外，大量可溶性物质如可溶性糖、氨基酸、可溶性蛋白等的积累，增加了细胞液渗透压，提高了细胞吸水和保水能力，避免原生质脱水凝固，从而保护植物细胞免受低温伤害[30-31]。脯氨酸是水溶性最大的氨基酸，研究結果表明低温胁迫下脯氨酸可增加酶稳定性，保护酶活性，减轻质膜损伤，清除羟自由基，从而稳定蛋白质、DNA和细胞膜[32]。高等植物在逆境胁迫下，脯氨酸的积累是一种常见的生理反应。在植物体内，脯氨酸的合成由谷氨酸或鸟氨酸开始，其中谷氨酸合成途径中，P5CS是该过程的限速酶。近几十年来，P5CS基因反馈调节在控制植物脯氨酸水平上扮演着重要的角色，脯氨酸含量的变化也影响着植物对逆境胁迫的响应[33-34]。在拟南芥中低温胁迫可通过NIA1基因的表达促进植物内源NO合成，上调P5CS基因的表达，促进脯氨酸的积累，提高植株的抗寒性。本研究结果表明，外源NO处理后的山茶在低温胁迫下，其可溶性糖、可溶性蛋白和游离脯氨酸含量均显著高于低温胁迫处理的山茶。王芳等用 0.10 mmol/L SNP处理低温胁迫下的玉米幼苗，其可溶性蛋白和可溶性糖含量分别增加了19.25%、123.0%，可有效缓解低温胁迫对玉米幼苗生长的抑制效应[26];杜卓涛等以 0.50 mmol/L SNP处理苦瓜幼苗时也显著促进了渗透调节物质的合成，提高了低温胁迫下植株生物量，增加了苦瓜的抗冷性[35]，本研究结果与之一致。说明外源NO可诱导可溶性糖和可溶性蛋白的积累，减轻低温胁迫对植株造成的伤害，提高植株对低温的适应性。牟雪姣等的研究结果表明，外源NO能够提升常温及低温胁迫条件下蝴蝶兰叶片内的渗透调节物质含量[36]，而本研究及杨美森等在棉花上的研究结果[11]则表明，常温下外源NO处理植株渗透调节物质含量虽有一定量的增加但不显著，这可能是使用SNP浓度不同或者不同植物对外源NO敏感性不同而引起的，其机理有待进一步研究。

3.3 外源NO对山茶叶片膜脂过氧化和抗氧化酶活性的影响

逆境胁迫下，植物细胞内ROS动态平衡受到破坏，导致O-2·、羟自由基、H2O2等活性氧迅速积累，活性氧能够与植物体内的蛋白质、DNA和脂类物质反应，最终对植物体造成伤害[37]。MDA则是植物体在衰老或逆境条件下，发生膜脂过氧化作用的最终分解产物，能破坏细胞膜的结构，使细胞内溶物扩散到细胞外，逆境胁迫下会大量积累。SOD、CAT和POD是植物的抗氧化系统重要的保护酶，可保护植物免受活性氧的伤害。NO可通过增加SOD、CAT、POD等抗氧化酶活性来增强细胞抗氧化能力[28，38-39];外源NO在逆境胁迫下可提高植株抗氧化酶活性已在多种植物上得到证实[9，11，26，34]。本研究中，低温胁迫下 O-2·生成速率加快，MDA和H2O2的含量显著增加，SOD、CAT和POD的活性明显增强;外源NO 处理提高了低温胁迫下山茶SOD、CAT和POD的活性，降低了MDA和H2O2的含量，减缓了O-2·生成速率，缓解了冷害胁迫下膜质过氧化作用对细胞的伤害，提高了山茶的耐冷性，研究结果与南瓜[9]、棉花[11]、玉米[26]、蝴蝶兰[34]等的研究结果一致。证明外源NO处理确实在一定程度上提高了山茶对低温胁迫的适应性。低温胁迫下，导致植物发生一系列的生理生化变化，包括ROS动态平衡也受到破坏[8]，而NO作为信号分子在逆境胁迫下可通过参与不同的过程基因，如信号转导、防御和细胞死亡、转运、代谢以及ROS产生和降解相关基因，以促进O-2·转化成H2O2和O2，并且通过增强H2O2清除酶活性，最终抑制植物的氧化损伤[40-41]。

4 结论

低温胁迫下，山茶幼苗叶绿素含量显著降低，超氧阴离子自由基增加，膜脂过氧化程度增加，生长受到显著影响。外源施加100 μmol/L SNP溶液，在低温胁迫下显著增加了可溶性物质含量，提高了抗氧化酶SOD、CAT、POD活性，降低了O-2·产生速率，减少了H2O2和膜脂过氧化物产物的积累，最终有效缓解了低温胁迫对山茶花造成的伤害，从而增强了其抗寒性。2个品种相比，六角大红O-2·生成速率、H2O2含量和MDA含量均低于花鹤翎，而其叶绿素、可溶性物质含量、抗氧化酶活性均显著高于花鹤翎，因此六角大红的抗寒性优于花鹤翎。外源NO能提高花鹤翎和六角大红的抗寒性，花鹤翎和六角大红花期不同、抗寒性不同，将花鹤翎和六角大红配合栽植，并施以外源NO提高抗寒性，对北方山茶花品种引进以及安全越冬具有一定的指导意义。

除了山茶花具有较高观赏价值以外，山茶属植物都具有很高的利用价值，经济植物茶树是世界三大无酒精饮料之一;油茶组合红山茶组种子含油量高;金花茶组种类繁多，是著名观赏花木，然而这些重要经济植物喜温暖湿润环境，目前主要分布于东亚北回归线两侧。由于木本植物生长慢、育种周期长，外源NO处理已有效地提高了山茶的抗寒性，深入研究其在山茶属植物低温胁迫中的作用，对于扩大山茶属植物的分布范围，尤其是其北方分布，对于丰富北方道路、庭院、住宅、景点等花卉品种具有重要意义。

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