不同浓度尿素胁迫下苗期小麦根部形态和生理指标的变化

单折 崔东洁 代西梅

摘要：以常规小麦品种偃展4110为试验材料，通过水培试验，研究生理指标的变化与植物抗逆性之间的关系。设置6个氮素浓度水培处理，在不同浓度的氮（尿素）胁迫下，对苗期小麦根部进行了生理生化测定，并对其根尖形态进行了激光共聚焦扫描显微观察。结果表明，脯氨酸通过改变自身累积量在植物适应逆境中发挥了渗透保护剂的作用;可溶性糖含量则由于高氮胁迫出现了下降的趋势;在适当浓度的氮素胁迫下，根系活力强于高氮和低氮处理;镜检结果显示，尿素胁迫使小麦根尖细胞产生了不同程度的损伤，这些都可能与植物抗逆性存在某种相关性，为逆境植物的进一步研究提供理论依据。

关键词：小麦;氮胁迫;生理指标;显微观察;根部形态

中图分类号： S512.1+20.1 文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2019）20-0108-04

水、肥作为农作物整个生长周期中最重要的2个影响因素，对于农作物增产和保持高产发挥了重要作用。在北方大部分地区，农作物生长过程中获取土壤水分的主要来源是降水，因而肥料的合理施用成为农作物能否获得高产的关键[1]。禾本科作物（如小麦、水稻、玉米等）对氮的需求量大，对磷、钾需求量小，因此，合理施用氮肥（尿素）成为作物正常生长、顺利达到预期产量的重中之重。肥料的施用一般分2步进行[2]，即播种前深施基肥和生长期撒施追肥。可根据作物具体的生长状况在不同的生长阶段适量追肥，这样有助于作物顺利完成营养生长和生殖生长。在作物大面积种植的过程中常常会出现施肥不足或施肥过量的情况，施肥不足会导致作物生长缓慢、叶片发黄、植株矮小、籽粒灌浆不足呈干瘪状，最终严重减产;而施肥过量则会造成作物贪青晚熟，也不利于作物生长。在氮肥施用过量的情况下作物叶片疯狂生长，植株间的透风性差，易发生病虫害，且组织柔软韧性差，易倒伏，这些都会影响最终的考种测产。从环境角度上来看，过度施用尿素会使土壤碱化，某些化肥还会在土壤中残留一些污染物，严重破坏了生态环境，进一步加剧了国内土地资源紧张的局面，在某种程度上是一种资源浪费，同时增加了农民的种植成本。而氮肥不足则会使作物出现严重的营养不良。因此，适量适时施用化肥才会在投入最少的情况下获得最高的产量回报。

此外，相关研究表明，在高氮或低氮条件下，植物细胞内部某些内含物（如脯氨酸、甜菜碱、各种糖类）的含量发生明显的变化[3]，这些内含物对于细胞进行正常的新陈代谢，维持细胞内外的渗透压具有重要作用。这些变化在植物根部表现得更为明显，因此，对于农作物来说可根据其根部内含物含量的变化对施肥水平进行一些调整，使作物能在条件最优的土壤环境下完成整个生长周期。通过进一步显微观察，初步认识不同氮素处理下小麦根尖所产生的细胞学变化，以期为今后的生产实践提供一定的参考。

1.1 材料

试验所用小麦为常规品种偃展4110。2017年8月挑取籽粒饱满的小麦种子消毒，25 ℃浸泡过夜，在纸床上进行发芽培养[4]。先在黑暗的条件下25 ℃催芽1～2 d，后转至温度为25 ℃、光—暗周期为12h—12h的光照培养室培养5 d，去胚乳后进行水培。水培选用正常MS培养液进行培养，根据试验需要添加不同剂量的尿素[5]。试验设置6个浓度梯度[6]：1号（氮素缺乏的MS培养液）、2号（MS培养液）、3号（氮素浓度为1 mmol/L的MS培养液）、4号（氮素浓度为10 mmol/L 的MS培养液）、5号（氮素浓度为20 mmol/L的MS培养液）、6号（氮素浓度为40 mmol/L的MS培养液）。其中，氮素来自尿素中所含的氮元素，2号为水培的正常氮素浓度。每2 d更换1次培养液，分别在水培的5 d和10 d后取材进行试验[7]。试验在郑州大学离子束生物工程实验室内进行。

1.2 提取组织液及各物质含量测定

1.2.1 脯氨酸含量的测定

根据曹建康等的《果蔬采后生理生化实验指导》中的方法[8]测定脯氨酸含量。

1.2.2 可溶性糖含量的测定

采用蒽酮试剂法[8]测定小麦根部可溶性糖含量。

1.3 根系活力测定

采用α-萘胺氧化法[9]对小麦的根系活力分别进行定性观察和定量测定。

1.4 根尖的荧光染色及显微观察

1.4.1 取样及固定 用解剖刀切取在不同尿素浓度条件下培养的麦苗根尖约5 mm，将其放入含有4%多聚甲醛的PEMS中固定，之后用PEMS缓冲液漂洗3～5次。

1.4.2 酶解 将“1.4.1”节处理后的根尖用含有质量浓度 1.5 g/L 溶壁酶、5.0 g/L果胶酶和10.0 g/L纤维素酶的PEMS酶解液在37 ℃条件下进行酶解，可适当在酶解液中加入甘露醇，有利于保持酶解过程中细胞内外的渗透势，便于细胞内细胞骨架维持原状。酶解结束后用PEMS缓冲液漂洗 3～5 次。

1.4.3 染色及制片 将“1.4.2”节处理后的根尖用含有1% Triton X-100的PEMS缓冲液处理1～2 h，同样经PEMS缓冲液清洗后，用荧光染料进行荧光染色，染色结束后用PEMS缓冲液进行漂洗，直至细胞外残余的荧光染料被洗净为止，采用抗荧光猝灭剂进行封片后，在激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）下进行显微观察[10-11]。

2 结果与分析

2.1 小麦外部生长状况

通过观察，小麦去胚乳轉入水培后在外部形态上显现出明显差异，图1为小麦水培1周后的生长状况。由图1可知，在不同氮素浓度下小麦植株高度和根部长度产生了明显变化，随着尿素浓度的增加，小麦的叶片数量减少，甚至在高氮条件的6号处理下部分叶片枯萎变黄，生长停滞不前，从后期试验中发现，随着水培时间的延长，6号中的烂根现象愈来愈明显;1号中的小麦与前期相比虽然在植株高度和根部长度上没有明显差异，但叶片颜色发黄，叶片呈细长型，其韧性不如正常植株，部分叶片出现从中间折断的现象。

2.2 脯氨酸含量的变化

通过试验测定，根据不同浓度氮素培养下小麦根部组织提取液的吸光度（D520 nm），并结合脯氨酸含量的标准曲线，代入公式计算得出各组相应的脯氨酸含量。由图2可知，随着施氮量的增加，脯氨酸含量总体呈现先增后减的趋势。这与朱虹等在逆境条件下脯氨酸对于植物生长影响的研究结果[12]相一致，即在一定范围内氮素浓度高于或低于正常值会使植物体内脯氨酸产生积累。

2.3 可溶性糖含量的变化

通过测定不同氮素浓度处理后苗期小麦根部可溶性糖的吸光度（D630 nm），根据可溶性糖含量的标准曲线及公式计算得出不同氮素浓度处理下小麦根部可溶性糖的质量分数，结果（图3）发现，苗期小麦根部可溶性糖含量的变化在水培5 d和10 d后有所不同，水培5 d后可溶性糖含量随着氮素浓度的升高呈先增加后降低的趋势，这与左文博等的研究结果[13]在一定程度上是相一致的。而水培10 d后，可溶性糖含量则出现先减后增再减的现象，这与郭相平等的研究结果[14]有一定差异，造成这种差异的原因可能是植物的可溶性糖对氮胁迫不如水分胁迫那么敏感。

2.4 根系活力的差异

对不同氮素浓度处理下苗期小麦根系活力进行定性观察，最终着色结果（图4）显示，缺氮（1号）和高氮（5号、6号）条件下的根组织着色较浅，这表明其根系活力弱于其他几组。试验测定不同氮素浓度胁迫下苗期小麦根系活力的吸光值（D510 nm），并根据α-萘胺含量标准曲线得出相应的α-萘胺浓度（图5）。6个处理的α-萘胺浓度关系为3号>2号>1号、4号>5号、6号，这表明适当的氮素胁迫可引起根系活力的[CM（25]增加。试验过程中α-萘胺自动氧化的数值是一定的，因此根据α-萘胺含量标准曲线所得到的α-萘胺浓度可作为根系活力定量测定的一个指标。

2.5 根尖荧光染色镜检结果

通过荧光染色镜检发现，苗期小麦的根部细胞在低氮或正常情况下能够保持完整的形态（图6-1），根冠部分呈椭圆的帽状，且薄壁细胞不规则地排列在一起，将分生区细胞包裹在内部。在氮素胁迫下，根尖细胞出现了不同程度的受损现象。图6-2中根尖顶端处的帽状结构已经完全脱落，根冠中的薄壁细胞出现了明显的结构变化;图6-3中根尖外围本应该包裹分生区细胞的薄壁细胞呈松散状，并有部分薄壁细胞脱离了根冠，帽状结构已经被破坏;图6-4中明显可以观察到根冠部分的荧光强度弱于分生区，且伴随有薄壁细胞脱离根尖的现象。经多次试验验证，图6-4中的现象大多出现在高氮胁迫（5号、6号）下的根尖细胞中;中氮条件（3号、4号）下出现图6-2、图6-3、图6-4中现象的频率低于高氮，而低氮（1号）或正常条件（2号）下出现这3种现象的频率又低于中氮，或者不出现。这表明氮素胁迫下，根冠薄壁细胞的结构受到一定程度的破坏，猜测这种破坏会影响根冠薄壁细胞对内部分生区细胞的保护功能。

3 结论和展望

对于禾本科作物来说，氮、磷、钾肥中最为重要的是氮肥，而尿素是主要的氮素来源，因此，作物能否顺利完成整个生长周期的关键在于是否合理施用尿素。在大田种植的区域内，往往可以观察到这样一种现象，同一品种的小麦生长状态很难达到齐性，这主要是由后期大田调控模式上的不同造成的[15]。冬小麦在播种后到出苗期这段时间主要靠胚乳供养，因此这段时期的生长状态基本恒定，紧接著是小麦的越冬期，由于冬季气温较低，麦苗几乎处于休眠状态，生长缓慢或停滞不前，因此其生长不会有明显的差别，之后在土壤基肥的肥力作用下，小麦越冬后直至返青期这段时期在生长状态上也不会表现出很大差异[16]。一般来讲，有经验的耕作者会在小麦拔节期到来之前进行追肥，在这个时期进行追肥一方面可以弥补土壤经历漫长冬季后的肥力不足，另一方面可为小麦孕穗期的到来积攒充足的肥料[17]，冬小麦的籽粒饱满与否取决于灌浆期的水肥条件，有研究表明，中水中肥的条件才能使小麦达到最高的产量指标[18]。

试验在6种不同浓度的氮素培养条件下，对苗期小麦的一些生理指标进行了测定，并对不同水平处理的材料进行了差异性比较[19]，在进一步的显微观察中发现了细胞水平的不同。本研究结果表明，在一定浓度的氮素胁迫下，苗期小麦通过调整自身脯氨酸的累积量来调节细胞内外的渗透势，从而平衡机体的渗透压，因此，脯氨酸起到渗透保护剂的的作用[20]，此外，在氮素浓度高出一定范围之后，脯氨酸含量呈现下降趋势并最终趋于平缓。对于不同的逆境胁迫，植物可能会有不同的抗逆途径，试验中，水培5 d后小麦根部的可溶性糖含量随着氮素浓度的升高呈先增加后减少的趋势，而1号、3号和4号水培10 d后小麦根部的可溶性糖含量明显高于2号，并随着氮素浓度的继续增加可溶性糖的含量明显下降。虽然引发这种现象的机制还不是很明了，但从另外一些研究结果中猜测，可能是由于可溶性糖在高氮胁迫下不敏感，也可能是由于高氮条件破坏了可溶性糖合成的某些前体物质，导致可溶性糖含量的降低。根系活力定性观察和定量观察的结果表明，在适当高氮条件下的根系活力强于低氮和超高氮，这说明适度的氮素浓度能诱发植物根系产生更多的过氧化氢酶或活性氧促使α-萘胺氧化，从而使大量的红色沉淀附着于根表面。在镜检过程中，氮素胁迫下的视野中更容易看到图6-2、图6-3以及图6-4中所显示的根冠受损的现象，这表明高浓度的氮素对于根冠的薄壁细胞有一定的破坏作用，氮素在渗透进入薄壁细胞的过程中，一方面可能破坏了细胞与细胞之间的胞间连丝结构，导致整个帽状结构脱落，或部分细胞从根冠帽状结构上分离形成单个细胞，另一方面氮素的进入可能增大了薄壁细胞细胞膜的分子筛直径，在荧光染色的过程中大部分荧光染料进入细胞之后又在随后的漂洗过程中被洗脱掉，因而最终的镜检结果显示，根冠细胞荧光强度不高。

自然界中存在各种各样的逆境，在非生物胁迫下，植物自身会产生一系列的变化来适应这种逆境。同一植物对抗某种逆境会有不止一条抗逆途径，当然，不同的植物对抗同一逆境条件的途径也会有所不同，这就使得抗逆境植物的研究更加复杂，目前已经有多种分子生物学技术应用于植物抗逆性的研究，随着显微技术的发展，可通过显微观察为植物抗逆的分子机制提供更为直观的依据。

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