3株猪流行性腹泻病毒S1基因的克隆及序列分析

王婧 孙志雯 陈海峰 陈晓兰

摘要：猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）可感染各阶段的猪，使患病动物出现水样腹泻、呕吐，并伴随厌食和精神沉郁等临床症状，对哺乳仔猪危害尤为严重。为了解河南某猪场PEDV流行毒株S1基因的变异情况，以江苏农牧科技职业学院动物药学院实验室保存的感染PEDV临床病料为样本，对其进行S1基因扩增、克隆以及序列分析。对S1基因的进化分析结果显示，该猪场PEDV分离株S1基因推导的氨基酸序列之间的同源性高达99%，BLAST搜索结果显示与AHCZ-2株的相似性最高，将获得序列与经典毒株CV777相比在第57位插入了4個氨基酸NQGV，在第134位插入1个氨基酸D，而在第157、158位缺失2个氨基酸，在中和表位区域共有11处氨基酸突变，与国内其他毒株均位于G2-b进化分支，研究结果为进一步掌握该地PEDV的流行毒株和毒力变异情况提供了理论依据。

关键词：猪流行性腹泻病毒;S1基因;遗传进化

中图分类号： S855.3 文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2019）20-0099-04

猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea，PED）以急性肠炎为特征，在仔猪常由于致死性水样腹泻导致脱水死亡的高致死率疾病[1]。病原为猪流行性腹泻病毒（PEDV），该病毒可感染各阶段的猪，使患病动物出现水样腹泻、呕吐，并伴随厌食和精神沉郁等临床症状。仔猪的感染率可达100%，而母猪则不一定[2]。腹泻时的排泄物可在48 h内检测到PEDV病毒，甚至有时可延长至4周。PEDV可感染1周龄以内仔猪，引起严重水泄和3～4 d呕吐，随后出现严重脱水和电解质失衡而造成死亡，平均死亡率可达到50%，在1～3日龄仔猪死亡率甚至可达到100%，然后降低至10%。虽年龄大一点的猪比1周龄以内的仔猪初发时发病更轻，然而PEDV影响育肥猪的生长。母猪可能不会腹泻，但是通常会显示抑郁和厌食[3]。

PEDV是一个大的有囊膜RNA病毒，属于尼多病毒目（Nidovirales）冠状病毒科（Coronaviridae）冠状病毒属（Coronavirus）成员，其基因组共约28 kb，拥有5′端非翻译区和3′端非翻译区，共编码至少7个开放阅读框（ORF1a，ORF1b，ORF2～6）其中ORF1a和ORF1b共占了整个基因组5′端2/3用于编码非结构蛋白。剩余的3′端的基因共编码4个结构蛋白，分别是纤突蛋白（S）、膜蛋白（M）、小膜蛋白（E）和核衣壳蛋白（N）。其中S蛋白是病毒子包膜主要的envelope Ⅰ型糖蛋白，与病毒入侵以及刺激并诱导宿主产生中和性抗体密切相关。S蛋白可划分为S1（1～735 aa）和S2（736～1383 aa）2个结构域，蛋白S1结构域对于识别pAPN受体至关重要。PEDV进入细胞始于与pAPN结合，随后通过直接膜融合的方式与靶细胞完成内化的过程，随后并脱壳释放病毒基因组进入细胞内开始复制[4-6]。

另有研究表明，冠状病毒S蛋白的变异将会导致其宿主范围、组织细胞培养基毒力发生改变。其中存在较高变异性的主要是S1基因，不同分离株S1基因间存在不同程度的核苷酸插入、突变和删减等现象，进而改变病毒原始抗原特性，因此常被用来研究不同时间和地区流行毒株的亲缘关系[7]。

本研究于2017年12月至2018年3月在江苏农牧科技职业学院动物药学院实验室开展，主要对该实验室保存的猪流行性腹泻病料进行S1基因克隆，并运用DNAMAN、MEGA等基因分析软件进行序列分析，为进一步掌握PEDV的流行毒株和毒力变异情况提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 样品的采集

试验用病料为笔者所在实验室保存的感染流行性腹泻病毒仔猪肠道样品。

1.2 试剂

PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver.2（Dye Plus）一步法RT-PCR试剂盒、EX Taq酶、Marker DL 2000、Marker DL 5000、pMD18-T载体等，均购自TaKaRa宝日医生物技术有限公司;Trizol试剂，购自Invitrogen公司;普通质粒提取，购自天根生化科技有限公司;琼脂糖，购自西班牙Biowest公司;其他试剂均为国产分析纯。

1.3 样品处理及RNA提取

取保存病料的小肠组织加入适量液氮进行研磨稀释后，于4 ℃ 10 000 r/min离心10 min。吸取离心后上清液按照Trizol试剂提取RNA的操作步骤进行，最后将RNA溶解至DEPC水溶液中，于-20 ℃保存。

1.4 引物的设计

根据CV777毒株S基因序列作为参考，采用Primer 5.0软件进行引物设计，引物序列为：S1-F：5′-GCTTGTTGAAGAATGGTAAGTTGC-3′;S1-R：5′-AGCCTGCTCTGAAAAAGAACAT-3′，送上海生工生物工程有限公司进行引物合成。

1.5 反转录及基因的PCR扩增

根据试剂盒操作说明，配制RT-PCR反应液，将一步法酶混合物、Buffer、引物、提取的PEDV总RNA及RNase Free dH2O配制成25 μL反应体系，按照以下程序放入PCR仪进行反应，扩增条件为：50 ℃ 30 min，94 ℃ 2 min;94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，30个循环;72 ℃ 7 min，反应结束后吸取5 μL反应液进行1.5%的琼脂糖凝胶电泳。

1.6 S1基因的克隆

电泳检测条带和目的条带一致后，吸取PCR反应混合液3 μL，pMD-18T载体1 μL，Buffer 5 μL，灭菌水1 μL，混合均匀后置于16 ℃连接2 h，并转化至JM109感受态细胞，进行蓝白斑筛选，采用PCR法进行鉴定，鉴定成功后将阳性菌株送上海生工生物工程有限公司进行测序。

1.7 序列分析

将测序得到序列采用DNA MAN软件进行翻译。对翻译推导所得的蛋白质序列进行BLASTp分析、并与经典毒株CV777序列进行多序列比对，并分析其突变位点。最后与近年国内外流行的毒株进行多序列比对，采用Mega软件进行进化树构建，选择毒株信息见表1。

2 结果与分析

2.1 PEDV S1基因的扩增及克隆

将提取的PEDV RNA样品进行反转录PCR扩增，结果显示目的条带约2 188 bp，将PCR产物与pMD-18T载体进行连接，并转化至E.coli JM109感受态细胞中，采用PCR方法对重组质粒进行鉴定，将鉴定结果为阳性的克隆菌株送测序公司进行序列测定，PCR扩增结果见图1。

2.2 PEDV S1基因的序列分析

通过测序得到3条S1序列，分别命名为CH/HNZK1、CH/HNZK2、CH/HNZK3，长度均为2 188 bp，共编码约720个氨基酸，3株PEDV分离株S1基因的核苷酸序列和推导氨基酸序列相似性为99%。对3条S1基因核酸序列进行BLAST搜索，结果均与AHCZ-2株的相似性最高，高达99%。

将推导氨基酸序列与经典毒株CV777相比，在第57位插入了4個氨基酸NQGV，在第134位插入1个氨基酸D，而在第157、158位缺失2个氨基酸，与王飞等报道的我国部分地区PEDV S基因的蛋白序列[8]相似。进一步采用Clustal Omega在线软件对所得3个S1基因推导蛋白质序列和经典毒株CV777的序列进行多序列比对发现，在中和表位区域（499～638 aa）共有11处突变，分别是517位A→S，521位 L→R，523位S→G，527位V→I，542位D→G，549位T→S，594位G→S，605位A→E，619位F→S，621位K→T，635位 I→V。而在预测的2处受体结合域（25～88aa、249～529 aa）分别有10处以上氨基酸突变或插入和缺失。具体突变氨基酸位点见表2。

2.3 PEDV S1蛋白遗传进化分析

主要选择PEDV经典毒株CV777，中国周边各国的疫苗株、经典流行株，及近年来在我国境内分离到的部分毒株与本试验克隆所得到的3株PEDV毒株S1基因推导氨基酸序列进行多序列比对，并利用MEGA 5软件，N-J法进行遗传进化树的构建，结果见图2。

利用筛选得到的共50株代表毒株及本研究获得的S1蛋白氨基酸序列构建遗传进化树，可见进化树可分为G1和G2 2个大分支，每分支可划分为a、b 2小分支，本次试验所得3株S1蛋白均位于G2-b分支，位于同一分支的还有中国境内YC2014、CH/GDZH02/1、CH-SCAY-2014、HBXY-1、CH-QTC-01-2015和美国流行株USA/Colorado、CHGD-01，提示与本次分离毒株关系较近。韩国经典毒株Chinju99、NJ02、KNU-0801和日本的KH野猪毒株均位于G2-a分支。美国流行的经典株CV777以及LZC、DR13、Brl/87等均位于G1-a分支，CH/JLGZL/2011、JS-2004-2位于G1-b分支，而与乔涵等报道的河南分离株均位于G2[9]分支相似。

3 讨论

PEDV于1982年日本首次报道后便在亚洲各国迅速流行。2000年以后，PEDV在菲律宾、泰国、越南和我国台湾等地报道日益增加[10-11]。在90年代早期，经典毒株CV777的灭活苗在中国广泛被应用，直到2010年PED只有少数暴发[12]。但是，在2010后期PED的流行在养猪大省死灰复燃，我国科学家对这段时间PEDV的分子流行病学进行了大量调查。从2011年2月至2014年3月，我国进行了除西藏、海南和港、澳、台的29省的大规模调查。样品阳性率从61.1%到78.49%，猪场阳性率在71.43%～83.47%[13]。

2017年3月在河南周口某猪场出现大量哺乳仔猪腹泻，通过对仔猪肠道样品进行PCR以及血清ELISA检测确定本次为PEDV感染。由于RNA聚合酶缺乏矫正功能，所以RNA病毒容易发生变异[3]。PEDV的S基因为纤突蛋白基因，是结构蛋白中最大的基因，是主要的免疫蛋白基因，能诱导机体产生抗体。而S基因可变区主要集中在S1区（1～735 aa），因此通常分析S1蛋白的序列变化情况来研究PEDV的遗传进化关系。本研究对采集的样品进行了S1基因的扩增和进化分析，结果显示3份样品的S基因与疫苗株CV777相比相似性在99%，虽然表现出极高的相似性，但是这3株新分离毒株相对经典疫苗株在中和表位区域（499～638 aa）[14]共有11处氨基酸突变，有研究报道在该结构域氨基酸突变易影响S蛋白的疏水性[15]。尤其值得注意的是被检毒株S1蛋白中和表位区域的549位T→S、594位G→S突变现象，549位和594位为S蛋白的中和表位结构域，这些位置的突变可能和免疫动物发病具有重要联系，我国自2011年后分离的PEDV这2处均突变为丝氨酸，而与2002—2009年期间分离到的PEDV毒株2处的突变情况差异较大[16]。

在2010年后的这些年，属于G1-b基因群的新的变异毒株在中国被首次报道。另外，免疫动物的PED暴发使CV777毒株疫苗的保护性产生了质疑。至此，PEDV在中国的不同地区流行被陆续报道。目前，中国PED暴发主要是由于G1b变异株和与CV777不同基因型的G2流行野毒[17]。对此次分析的3株PEDV病毒进行遗传进化分析显示均属于G2-b分支，从亲缘关系看与在河南省附近其他省份分离到的PEDV毒株亲缘关系较近。这与周兵强等分析的M基因和ORF3基因结果[18]一致，与经典毒株以及疫苗株均发生了变异，而与2010年后国内流行的大多数毒株的同源性较高。本研究对进一步跟踪监测河南省PEDV分子流行特征，以及制定综合防控措施和新疫苗的研发具有重要意义。

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