辛伐他汀片在比格犬体内的药代动力学研究

赵玉丛，王笃学，邹华威

(河南牧业经济学院 动物医药学院，河南 郑州 450046)

辛伐他汀(Simvastatin ，SV)是一种新型的调脂药物，可以通过抑制内源性胆固醇的合成，达到调节机体中血脂的作用，是治疗高脂血症的首选药物之一[1,2]。为了进一步研究辛伐他汀的体内代谢，为其在人体内的生物利用度研究提供依据，本试验用雄性比格犬作为实验动物，采用LC-MS/MS联用技术，用单剂量辛伐他汀片灌服比格犬后，测定了SV在比格犬体内的血药浓度，使用WinNonlinV5.2.1统计软件计算出药动学参数，并与同类文献中SV的药动学相关数据进行了对比。

1 材料

1.1 试药

辛伐他汀片(北京万生药业有限公司产品，规格:40mg/片)；辛伐他汀对照品(购于中国药品生物制品检定所，纯度：100.0%)；内标:普萘洛尔(Propranolol，上海睿智化学研究有限公司提供)。

1.2 仪器

LC-MS/MS-21 (API6500, Qtriple)(日本岛津公司产品)、XW-80A旋涡混合仪(海门其林贝尔仪器制造有限公司产品)、5415R型台式低温离心机(艾本德中国有限公司产品)。

1.3 动物

健康雄性比格犬3只(编号分别为1号犬，2号犬，3号犬)，体重7kg-10 kg，由上海睿智化学研究有限公司大动物研究中心提供。实验前正常饲养2周且未服任何药物。并在实验前12h禁止喂食，但是可以饮水。

2 LC-MS/MS分析条件

2.1 色谱条件

waters BEH C18色谱柱(2.1×50 mm, 1.7 μm)，柱温60 ℃；流动相选择A、B混合流动相进行梯度洗脱，流速0.6 mL·min-1(见表1，其中A为含0.025%甲酸和1 mmol·L-1醋酸铵的水溶液，B为含0.025%甲酸和1 mmol·L-1醋酸铵的甲醇溶液)；进样量10 μL。

2.2 质谱条件

采用ESI离子源，MRM检测模式，MRM监测离子对为辛伐他汀：Q1/Q3 Masses: 441.50/325.20 Da，内标普萘洛尔：Q1/Q3 Masses: 260.10/116.20 Da。

表1 梯度洗脱条件

3 方法与结果

3.1 对照品储备液及内标溶液的配制

配制浓度为200 μg·mL-1的辛伐他汀母液，再将辛伐他汀母液用乙腈-水(v/v，1：1)稀释，得浓度分别为0.02、0.04、0.2、0.6、2、6、20 μg·mL-1的对照品储备液，冰箱冷藏保存。

精密称取适量内标普萘洛尔，用乙腈溶解配制成1 mg·mL-1的普萘洛尔储备液，在4℃的冰箱中保存。临用前用乙腈稀释得内标溶液(浓度40 ng·mL-1)。

3.2 标准血浆样品的配制

分别取各对照品储备液10 μL于干燥离心管中，再加入内标溶液(普萘洛尔浓度为40 ng·mL-1)10 μL，再加入空白血浆180 μL，配成辛伐他汀浓度分别为 1、2、10、30、100、300、1000 ng·mL-1的系列标准血浆样品，冰箱冷藏保存。

3.3 给药剂量的确定

于实验前将3只雄性比格犬分别称重，称其体重分别为7.67 kg，7.84 kg，7.76 kg。根据表2中不同实验动物与人等效剂量比值，查得犬与人的等效剂量比为1.87。按阿伐他汀的人用剂量每日0.5 mg/kg，计算得出1号、2号、3号比格犬有效给药剂量分别为7.133 mg、7.291 mg、7.217 mg。取1片辛伐他汀片(规格为40 mg/片)称其质量为224.6 mg，最终计算得出1号、2号、3号比格犬分别给予辛伐他汀片的质量为40.1 mg、40.9 mg和40.5 mg。

将辛伐他汀片粉碎均匀，分别称取40.1 mg、40.9 mg、40.5 mg装入3只胶囊中并编号为1、2、3。

表2 不同实验动物与人等效剂量比值(剂量按mg/kg算，人按60kg算)

3.4 血浆样品的采集

利用给药器将3只胶囊分别对相应编号的比格犬进行给药，在给药之前及给药之后的0.083 h、0.25 h、0.5 h、1 h、2 h、4 h、6 h、24 h作为采血时间点，分别从比格犬前肢桡静脉采取0.5 mL血液，置于加有EDTA-K2抗凝剂的离心管中，混匀，离心5 min(离心条件4 ℃、3 000 r·min-1)，将上清液在-80 ℃的条件下冷冻保存、备用。

3.5 血浆样品的处理

将上述条件下保存的血浆样品在室温下融化后，取30 μL置于EP管中，再在EP管中加入150 μL含有内标普萘洛尔(浓度为40 ng·mL-1)的乙腈，涡旋振荡混合5 min后，在转速为5 800 r·min-1的条件下离心10 min，取2 μL上清液，注入LC-MS/MS仪中进行分析。

3.6 方法学考察

3.6.1 专属性考察

按上述色谱-质谱条件，分别测定来自6个不同样本的空白血浆、空白血浆添加SV和内标、及给药后4 h的血浆样品，结果显示SV和内标普萘洛尔的保留时间分别是1.21 min和1.03 min，二者可以完全分离，表明SV和内标的测定不受血浆中其他内源性物质的干扰。

3.6.2 标准曲线和定量下限

将“3.2”项下制得的标准血浆样品，按“3.5”项下方法处理后分别进样分析。以比格犬血浆中SV的浓度为横坐标，以SV与内标Propranolol的峰面积比为纵坐标，采用加权最小二乘法进行回归计算，得回归方程Y=0.0027X-0.004 (r=0.99993)，SV血浆浓度在1-1000 ng·mL-1范围内线性关系良好。以标准曲线的最低点浓度作为最低定量限，定量下限为1 ng·mL-1。

3.6.3 回收率考察

取高(3 μg·mL-1)、中(1 μg·mL-1)、低(0.1 μg·mL-1)浓度的标准血浆样品、每个浓度各5份作为质控样品，按“3.5”项下方法处理后，计算提取回收率，用标准曲线计算方法回收率，结果见表3。由表3中可知SV的回收率考察结果均满足生物样品分析的要求。

表3 血浆中SV的回收率(%，n=5)

3.6.4 精密度考察

取上述高(3 μg·mL-1)、中(1 μg·mL-1)、低(0.1 μg·mL-1)浓度质控样品，每个浓度各取5份，按“3.5”项方法处理，计算日内精密度。每天取上述浓度质控样品，每个浓度各取3份，连续3 d按“3.5”项下处理，计算日间精密度。结果见表4，RSD均小于6%，满足测定要求。

表4 SV的日内、日间精密度(%，n=5)

3.7 血药浓度-时间曲线与药代动力学参数

分别于上述色谱-质谱条件下，测定各时间点3只比格犬血浆中SV的浓度，数据见表5。3只健康雄性比格犬在口服阿伐他汀片(口服剂量为0.93 mg/kg)后的血药浓度-时间曲线见图1。

将按上述色谱-质谱条件所测得的血药浓度-时间数据用WinNonlin V5.2.1统计软件选择非房室模型进行计算，得到SV在比格犬体内的主要药代动力学参数。SV在比格犬血浆中的末端消除速率(Ke)选择末端消除法来进行计算，在比格犬体内的药时曲线下面积(AUC)选择线性梯形法或者对数梯形法来进行计算。

表5 各时间点3只比格犬血浆中SV的浓度

图1 3只健康雄性比格犬口服辛伐他汀片的血药浓度-时间曲线

选择非房室模型来计算辛伐他汀在比格犬体内的主要药代动力学参数，计算结果见表6。由表6可知，辛伐他汀在3只健康雄性比格犬体内的药代动力学参数差异较为明显。

表6 SV在比格犬体内的主要药代动力学参数

4 讨论与结论

临床应用剂量的辛伐他汀在体内经肝脏代谢后，血药浓度较低，要对SV进行定量测定必须要求所用的分析方法有极高的灵敏度，故一般的HPLC方法难以满足其分析要求。本试验建立了SV在比格犬体内血浆中的HPLC-MS/MS分析方法，该方法分析时间短(仅1.21 min)、灵敏度高、专属性强、样品处理简单、定量下限较低(1 ng·mL-1)，可满足辛伐他汀在比格犬体内血药浓度的测定及药代动力学研究的要求。

本试验中血样直接用乙腈沉淀蛋白后进样分析，省略了萃取、过固相柱等繁琐步骤，与文献方法比较[3-5]，该方法操作简单、内源性物质干扰少、成本低、提高了样品处理效率，适用于大批量生物样品浓度的检测。

本试验中辛伐他汀在3只雄性比格犬体内的药动学参数差异较大，与文献报道一致[6-8]，就本试验来分析，原因可能与比格犬个体化差异大有关，这提示临床用药时要注意个体化给药。本试验的研究可为辛伐他汀药物的临床合理应用提供参考价值。