红枣中γ-氨基丁酸的研究进展

王丽玲，蒲云峰，李雁琴，侯旭杰,2,*

(1.塔里木大学 生命科学学院，新疆 阿拉尔 843300；2.南疆特色农产品深加工兵团重点实验室，新疆 阿拉尔 843300)

枣(ZiziphusjujubaMill.)是鼠李科(Rhamnaceae)枣属(Ziziphus)植物的成熟果实，是枣属植物中栽培面积最广和经济效益最高的一个栽培种[1]。枣树原产于我国黄河中下游地区，是我国古老的特有果树之一，有文字记载的栽培历史至少有3 000多年[2]。由于枣树具有耐盐碱、抗旱、耐低温、适应性强等特征，已广泛分布于亚洲、欧洲、美洲、非洲、大洋洲的国家和地区。目前，我国枣树栽培面积近200万hm2，枣果产量已达824.1万t。红枣不仅富含碳水化合物、氨基酸、有机酸、矿物质及维生素等营养物质[3-4]，还含有多糖、cAMP、皂苷、生物碱、黄酮和三萜类等功能成分[5]，具有抗氧化、降血压、镇静安神、防治心脑血管疾病、改善记忆力、提高免疫力等功能[6-7]，是集药、食、补三大功能为一体的药食兼顾的天然保健食品。

1 红枣改善睡眠功能

我国最早的中医药著作《神农本草经》中将红枣作为药材收录，并记载其具有延长寿命、补血、促进睡眠等功效[8]。《本草纲目》中记载“大枣味甘，平。主治心腹邪气，安中，养脾，补少气少津，除烦闷等”，并且还记载了一条治疗烦闷不眠的附方：“大枣十四枚，葱白七根，加水三升煮成一升，一次服下”[9]。在2015版《中国药典》中也记载“大枣具有补中益气，养血安神，用于脾虚食少，乏力便溏，妇人脏躁”[10]。此外，《金匮要略》中的“甘麦大枣汤”和《伤寒论》中的“柴胡桂枝汤”的主要成分也是红枣，它们在传统中医中常被用于治疗抑郁、失眠等疾病[11]。虽然这些中医药著作是长期医疗实践的经验总结，说明红枣具有促进睡眠的功能，但红枣促进睡眠的分子机制仍然不清楚，难以用科学的理论去解释红枣的功效。

失眠是最为常见的睡眠障碍类型，虽不属于危重疾病，但会对正常生活和工作产生负面影响，并能加重或诱发心血管疾病。据流行病学调查，我国有45.4%的人曾经历了不同程度失眠[12]，并且失眠会随着年龄增长而增加[13]。由于传统中药多用红枣治疗以失眠为主的神经衰弱症，因此挖掘红枣中具有治疗失眠功效的化学成分并鉴定日益受到关注。目前，已有大量文献报道了枣的化学成分及生理功能，早期的研究认为皂苷是枣中具有镇静和促进睡眠的有效成分，而韩国学者Won等[14]研究发现酸枣仁中黄酮和皂苷均具有镇静和促进睡眠的功效，由于酸枣仁中黄酮含量比皂苷高，因此他认为起主要作用的是黄酮。后来，Jiang等[13]比较了枣中黄酮、皂苷和多糖对小鼠的镇静催眠效果，发现皂苷的镇静催眠效果优于黄酮，而多糖没有镇静催眠作用。Cao等[15]研究了酸枣仁皂苷(jujubosides)对小鼠的镇静催眠效果，发现酸枣仁皂苷可能是一种重要的促进睡眠的物质。近期研究报道，Song等[16]以Sprague-Dawley小鼠为研究对象，发现不仅酸枣仁皂苷A(jujuboside A)具有抗焦虑和镇静作用，而且它的代谢物(酸枣仁皂苷B和酸枣仁苷元)也具有相同功效。综合来看，已有研究表明皂苷很可能是红枣中具有镇静作用的有效成分。

Zhao等[17]采用高效液相色谱- 蒸发光散射检测器(high performance liquid chromatography-evaporative light scattering detector,HPLC- ELSD)法分析9种酸枣仁样品中的皂苷，它们的皂苷含量在0.232～0.824 mg/g。在笔者研究团队前期研究中，以骏枣为原料，通过溶剂提取和大孔树脂纯化，获得富含皂苷的组分，其得率为0.019% (即相当于0.19 mg/g)[18]。有研究报道，以剂量为40 mg/kg[13],25 mg/kg和9 mg/kg[16]的红枣皂苷饲喂小鼠，能够获得镇静和促进睡眠功效。如果按红枣含0.8 mg/g皂苷和达到促进睡眠功效的皂苷剂量9 mg/kg计算，一个体重80 kg的人每天至少需要吃0.9 kg红枣才能达到促进睡眠的功效，该消费量远超过人们正常红枣消费量。因此，皂苷可能不是红枣中促进睡眠的主要活性物质。

2 红枣中γ-氨基丁酸的发现

在Song等[16]研究中发现酸枣仁皂苷B和酸枣仁苷元通过影响γ-氨基丁酸A受体(γ-aminobutyric acid A receptor,GABA(A))的表达与激活，从而产生促进睡眠的功效。我们猜测GABA(A)的天然配体——γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)可能是红枣中促进睡眠的功效成分。

GABA是一种非蛋白氨基酸，它广泛分布于微生物、动物和植物体内[19]。GABA被认为是中枢神经系统(central nervous system,CNS)中重要的抑制性神经递质[20]，其作用是降低神经元活性，防止神经细胞过热，从根本上镇静神经，从而达到抗焦虑的效果[21]。此外，GABA还具有降血压、改善记忆、抑制癌细胞增殖、增强免疫、减少失眠等功效[22-25]。近年来，一些研究分析了部分水果中的GABA质量分数，如红毛丹鲜果710 μg/g[19]、草莓鲜果1 560～3 640 μg/g[26]、葡萄鲜果146 μg/g[27]、枇杷鲜果15.6～36.4 μg/g[28]、龙眼干果1 998 μg/g[29]、荔枝鲜果1 700～3 500 μg/g[30]和欧李干果140 μg/g[31]等。

鉴于此，我们采用氨基酸自动分析仪法比较了含GABA的氨基酸标准品和红枣样品的色谱图，见图1，发现在21.32 min处，红枣样品和氨基酸标准品的色谱图中均出现了保留时间相同的峰，表明红枣中含有GABA。此外，从红枣的色谱图可以看出，GABA的色谱峰比大多数游离氨基酸的色谱峰高，这说明红枣中不但含有GABA，而且其含量较高。

图1 红枣样品和氨基酸标准品的色谱Fig.1 Chromatograms of jujube sample and amino acid standard sample

在随后的工作中，我们采用HPLC法分析了7个品种鲜枣中GABA含量，其干枣质量分数范围为150.31～333.37 μg/g，其中骏枣和骏优2号中GABA含量最高，而冬枣最低[32]。Okada等[25]以20名更年期女性为研究对象，每日给予含26.4 mg GABA的脱脂大米胚芽，发现超过65%患者的失眠、睡眠障碍和抑郁症状得到明显改善。如果参考这一剂量，每天摄取约200 g鲜枣，就可产生促进睡眠的功效。

然而，在《本草纲目》中描述红枣：“大的是枣，小的是棘；大枣即晒干的大枣”[9]。在《中国药典》(2015版)也记载“大枣为鼠李科植物枣树的干燥成熟果实。秋季果实成熟采收，晒干”[10]。这表明入药是指大个干制红枣，而不是鲜枣或干制小红枣。骏枣是新疆主栽的红枣品种之一，主要用于干制及加工，也是典型的大枣品种。因此，我们分析了采摘、干制和贮藏对骏枣中GABA含量的影响，发现2016年11月采摘的鲜枣(水分36.44%)GABA占干枣质量分数达628.74 μg/g，比2016年10月采摘的鲜枣(水分57.92%)GABA高了近1倍[32]。通常情况下，植物组织中GABA非常低，其新鲜组织中GABA的质量分数只有3.12～624 μg/g，但当遭受生物或非生物胁迫后，GABA含量会快速大量增加[32]。有研究报道，蔬菜和水果经低温胁迫处理，能够增加其GABA含量。经5 min的机械或冷刺激，大豆鲜叶中GABA含量增加到1～2 μmol/g，比处理前增加了20～40倍[34]；龙眼经预冷处理后，其GABA含量增加了89%[30]；温室栽培的菠菜经14 d冷胁迫(4～7 ℃)处理后，其GABA含量显著高于对照组[35]。经查询，2016年10月新疆阿拉尔气温在0～20 ℃范围内波动，即夜间温度常在0 ℃左右，而2016年10月下旬夜间温度常在-5 ℃左右。这说明骏枣采摘前可能因经历了自然冷胁迫，从而促进了骏枣中GABA的积累。

经55 ℃干燥24 h后，获得水分质量分数为20.03%的干制骏枣，导致GABA损失了13.50%；当干制骏枣常温贮藏6个月和12个月后，GABA分别减少了49.18%和77.44%[32]。Wang等[36]在制备GABA强化牛奶时，发现杀菌会导致GABA损失，升高温度会导致GABA损失显著增加，故认为美拉德反应是导致GABA损失的主要原因；此外，干果常温贮藏过程中，也会发生美拉德反应，从而导致游离氨基酸损失[37]。这说明干制和贮藏过程中，可能会因美拉德反应导致骏枣中GABA损失。

基于现有结果和分析，每天吃66 g鲜骏枣(水分36.44%)或61 g干骏枣(水分20.03%)，就能获得足够的GABA(26.4 mg)，从而达到促进睡眠的功效。在《中国果树志：枣卷》中记载：“骏枣平均果重22.9 g，最大果重36.1 g”[38]。即因此推断每天吃3粒骏枣就可能产生促进睡眠的功效。这与民间广泛流传的一句谚语“一日三枣，长生不老”正好相符。但如果是每次吃常温贮藏了6个月或12个月的干制骏枣，至少需要吃6粒枣或12粒。这也说明减少加工贮藏过程中GABA损失，是维持红枣功效的重要措施之一。因此，GABA作为红枣中一种重要的功能成分，应该也作为一个红枣加工及功能评价的重要指标。

3 GABA的测定方法

目前，GABA检测方法有氨基酸分析仪法、分光光度法、酶法、毛细管电泳法、薄层扫描法、高效液相色谱法等[39]。其中，分光光度法操作方法简单、检测成本低，但专一性差；氨基酸自动分析仪法样品前处理简单、操作简单，但检测费用高、分析周期长；酶法、毛细管电泳法等方法具有准确度高、专一性强，但操作复杂、检测成本高；邻苯二甲醛(o-phthalaldehyde,OPA)柱前衍生HPLC法具有试剂价格便宜、衍生时间短、衍生条件简单、过量试剂不干扰测定等优点，其应用最为广泛。然而，现有OPA柱前衍生HPLC法分析条件多照搬游离氨基酸的分析条件，这些方法存在流动相组成复杂、流速高、系统压力高、分析周期长等问题。如程威威等[40]分析发芽糙米GABA是以乙腈和25 nmol/L的乙酸钠缓冲液为流动相，流速1 mL/min，有机相初始体积分数10%(乙腈)，梯度洗脱，单次分析周期45 min；吴琴燕等[41]分析红茶GABA是以甲醇和10 mmol/L的磷酸盐缓冲液为流动相，流速1 mL/min，有机相初始体积分数10%(甲醇)，梯度洗脱，单次分析周期45 min；Chen等[42]分析蘑菇子实体和菌丝中GABA是以甲醇、水和50 nmol/L的乙酸钠缓冲液为流动相，流速1.2 mL/min，有机相初始体积分数17%(甲醇)，梯度洗脱，单次分析周期43 min。这些方法与文献中采用OPA柱前衍生HPLC法测定氨基酸的分析条件相似[43]，均是参考了氨基酸的分析条件，并不是专门用于GABA的分析。因此，有必要从简化流动相组成、提高初始有机相比例、降低流动相流速等方面开展OPA柱前衍生HPLC法分析GABA含量的条件优化。

4 研究展望

在前期取样分析的7种新鲜红枣品种中均检测到GABA，并且红枣可能因自然冷胁迫积累了GABA[32]。如果摄入3粒富含GABA的红枣，就能获得足够的GABA产生促进睡眠的功效，说明GABA可能是红枣中重要的活性成分，下一步应在前期研究的基础上对该功能进行验证。刘孟军等[44]主编的《中国枣种质资源》记录了881个枣种质资源和63个枣优株，而目前仅分析了7个品种的鲜枣及1个品种的采摘、干制和贮藏样品的GABA。因此，今后应扩大品种调查范围，开展采摘、干制和贮藏对红枣GABA形成及变化规律研究，更好地认识红枣中的GABA及红枣的功能价值。

目前，GABA的测定多采用OPA柱前衍生HPLC法，但现有方法多参考氨基酸测定的方法，存在流动相组成复杂、流速高、系统压力高、分析周期长等缺点。因此，开展红枣GABA研究，首先应针对现有HPLC法的不足，通过对流动相组成、流速、有机相初始比例等条件的优化，建立一种简单、快速、准确的GABA检测方法。