甲状腺微小乳头状癌术中冰冻未能明确诊断的原因分析

张 玲 李 理

按照WHO的标准，PTMC定义为原发于甲状腺内直径在10 mm以内的癌肿[1]。由于癌灶小、病灶隐匿和无临床症状，多数与良性结节并存。大多数病例是在甲状腺手术中偶然发现或术后病理检查或在尸体解剖中才被发现，少数由于颈部淋巴结转移而被发现。甲状腺乳头状癌的病理诊断主要依据核的特征：核拥挤重叠、毛玻璃核、核沟和核内包涵体等，但冰冻切片不出现毛玻璃核，且存在许多人工假象，加之肿瘤很小，这就使得冰冻病理诊断PTMC困难重重，现分析如下。

1 材料与方法

1.1 临床材料

收集中国中医科学院广安门医院病理科2013年10月至2018年5月术中冰冻未确诊的PTMC标本8例，术后均经石蜡切片和免疫组化染色确诊。8例均为女性，平均年龄45.6岁。

1.2 方法

组织标本均为手术切除后立即送检的新鲜标本，垂直于甲状腺被膜、间隔3 mm书叶状切开，肉眼观察可疑病灶充分取材，有钙化取周围软组织。采用LEICA CM 1950型恒冷式冷冻切片机，-22 ℃以下切片,切片厚5～7 μm,HE染色。对冷冻切片后组织及剩余组织用4%中性甲醛固定，石蜡包埋，切片厚4～5 μm，HE染色。免疫组化染色用EnVision法,抗体Galectin-3、HBME-1、CK19及试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司，每种抗体均设阳性及阴性对照，操作用LEICA公司BOND-MAX全自动免疫组化机；结果判定标准：CK19以细胞质出现棕黄色颗粒为阳性标准[2]，Galecctin-3以细胞质或细胞核出现棕黄色颗粒为阳性标准[3]，HBME-1以细胞膜出现棕黄色颗粒为阳性标准。

1.3 诊断标准

病理诊断标准参考甲状腺病理学专著[4]。

2 结果

2.1 大体检查

送检标本中4例切面可见灰白色结节，质硬，界不清，1例可见一钙化结节，1例疑见白色区域，2例切面未见灰白色区域、冰冻取材阴性。

2.2 镜下检查

冰冻切片的形态学特征见表1。

表1 延迟诊断、假阴性和取材漏检病例冰冻切片的形态学特征

注：“1、2、3、4”：延迟诊断病例，“5、6”：假阴性病例，“7、8”：取材漏检病例。

2.2.1 未能诊断的原因分析 4例延迟诊断，因为经验不足，不能准确判断核的形态学特征，其中2例为经典型，可见明确浸润，细胞核异型性明显，可见核内包涵体；1例见宽水肿的乳头、未见明确浸润；1例由小滤泡组成，可见浸润。2例为假阴性，其中1例钙化严重，加之淋巴细胞性甲状腺炎，背景杂乱，癌灶由小滤泡组成，细胞轻度异型，核的特征不明显；1例结节性甲状腺肿，局部见腺瘤样结构、无间质硬化和浸润；2例取材漏检，确实未见到有白色或黄色区域，剩余标本取材时也未发现有白黄色区域，只是临床怀疑，故将所有标本取材包埋，镜下发现癌灶。

2.2.2 冰冻所致石蜡切片的形态学改变 冰冻后石蜡切片与未冰冻处理的同一肿瘤组织石蜡切片进行对比观察，发现冰冻组织石蜡切片中肿瘤细胞核完全皱缩浓染无法准确判断其异型性，无法判断毛玻璃核、核沟、核内包涵体特征。5例未能于术中冰冻确诊的患者均在经过石蜡切片并由免疫组化HBME-1、CK19、Galectin-3进行联合弥漫阳性表达以及院外会诊后确诊为PTMC；3例由于病灶较小，免疫组化切片时病灶消失。CK19阳性表达定位于细胞质，中等至强弥漫阳性表达；Galectin-3阳性表达定位于细胞质，呈中等至强阳性表达；HBME-1阳性表达以细胞膜为主，呈中等至强阳性表达，主要位于滤泡的腺腔面，阳性信号连接成线状。

3 讨论

甲状腺乳头状癌(PTC)多数可见乳头结构，但是如果未见乳头，诊断乳头状癌就很困难。甲状腺乳头状癌的病理诊断标准主要依靠细胞核的特征：包括核增大、排列拥挤、重叠，毛玻璃样核，核轮廓不规则，核内假包涵体，核沟等[5-6]。

PTMC石蜡切片细胞核特点:①异型核：重叠排列，极性紊乱消失，异型明显，核型不规则，可见呈棱角，大小不一。极性紊乱表现在细胞核不再位于基底部，而是位于胞顶部;有时呈鞋钉样细胞或呈扁平细胞腺管结构。②毛玻璃样细胞核：染色质粗大聚集于核膜下，显得核膜厚而清晰，核仁常不明显。③核沟：与椭圆形核的纵轴平行的1～2条细沟，实际上是核膜皱褶。④核内假包涵体：在细胞核内出现红染、境界清楚的圆形结构，是核膜内折时封入的部分细胞质[7]。

与石蜡切片相比，术中冰冻切片诊断乳头状癌存在局限性：①乳头特征：冷冻组织无脱水及收缩效应，因间质水肿，伊红染色深浅不同，乳头轴心空淡呈空泡状，致使与滤泡不易分辨。②细胞核特征：冰冻切片中毛玻璃样核的特征消失，需要强调的是毛玻璃核只存在于组织石蜡切片，是组织在包埋或固定过程中存在的人为改变；核内包涵体不易辨认，核内包涵体是陷入核膜内的部分细胞浆，与周围胞浆的颜色一致，但有时可见核内白色空泡，这是是冰冻切片的人工假象，易与其混淆。③浸润行为：多呈浸润性生长或多灶状浸润，浸润于良性滤泡间及纤维瘢痕内，有的侵犯周围软组织，静脉可以受侵[8-9]。

PTMC是PTC的1种特殊亚型，它应该具备PTC的所有特征，但如果肿瘤最大径<3 mm且没有乳头结构时，无论是取材还是诊断，对病理医师都是极大的挑战，尤其是冰冻，细胞核没有毛玻璃样的特征，最可靠的特征是浸润纤维间质或周围良性滤泡间，但是本研究中有两例未见浸润，且细胞核异型性很小，只能依靠核拥挤、重叠、核沟和核内包涵体这些特征来诊断，其中一例冰冻切片未见浸润，但石蜡切片时可见浸润；还有一例钙化明显，此时的浸润很可能是假象，因为钙化明显时纤维化也明显，在纤维间质内的滤泡和浸润无法鉴别，只能依靠细胞核的特征来诊断；所以冰冻病理诊断的陷阱很多，这就要求病理医师在做冰冻病理时严格做到以下两点：①病理医师一定要认真仔细的检查甲状腺标本，行3 mm的垂直于被膜书页状切开，注意对颗粒状和灰白色区域等处取材、多做切面。本研究有两例<3 mm的PTMC冰冻时取材未能找到病灶，之后将剩余标本全部取材，镜下发现癌灶，因这两例术前病理医师都与临床医师沟通过，B超显示有非常可疑的结节，所以全部取材，故术前与临床多沟通，对准确的冰冻病理诊断很重要。②熟练掌握PTMC冰冻切片和石蜡切片病理特征，尤其是细胞核的特征一定要认真观察，虽然每个病例核的特征(核拥挤、重叠、核沟和核内包涵体)并不是全部能看到，但是总有部分特征比较明显，一定要认真查找，不可漏掉任何可疑之处，争取以后遇见PTMC不再漏诊和延迟诊断。