续苓健骨汤含药血清对MC3T3-E1细胞分化及增殖的影响

陈娟 陈赛楠 叶云金 李生强 谢丽华 黄景文 葛继荣

福建省中医药研究院骨质疏松证候基因组学重点研究室，福建 福州 350003

骨质疏松症 (osteoporosis，OP)是一种以骨量低，骨组织微结构损坏，导致骨脆性增加，骨折风险增高为特征的全身性骨病[1-2]。中医学将骨质疏松症归属为“骨痿”“骨痹”“骨枯”等范畴，基于中医“肾藏精”、“肾主骨”理论，肾精亏虚是本病发生的基本病机[3]。

续苓健骨方是课题组葛继荣研究员在中医理论指导下研发的治疗骨质疏松症的经验方，在长期临床实践中发现具有疗效明确、安全性好的特点。我们前期研究结果表明，续苓健骨方能显著提高骨质疏松模型大鼠的骨密度，增强模型大鼠的骨断裂点的载荷和应力[4-5]。本研究以MC3T3-E1细胞为研究对象，观察续苓健骨汤含药血清对成骨细胞的增殖及分化的影响，从细胞水平探讨续苓健骨方防治骨质疏松症的作用机制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1实验动物：3月龄清洁级雄性SD大鼠40只，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，实验动物许可证号：SCXK(沪)2007-0005，合格证编号：2007000530078。在福建省中医药研究院比较医学实验中心饲养[合格证号：SYXK (闽)2009-000]。各组动物在温度20～22 ℃，相对湿度65%～70%、光照周期12 h/12 h 的环境中饲养，给予普通饲料、自由饮水和活动。

1.1.2实验细胞：小鼠颅顶前成骨细胞亚克隆 14(MC3T3-E1 subclone14) 细胞株，购自中国科学院细胞库(货号GNM15)。

1.1.3实验药物：续苓健骨方组成：川续断(安徽省本草国药饮片有限公司，批号140708)、白术(安徽省本草国药饮片有限公司，批号15030801)、陈皮(安徽省本草国药饮片有限公司，批号150208)、赤芍(安徽省本草国药饮片有限公司，批号150306)、红花(安徽省本草国药饮片有限公司，批号140420)和甘草(安徽省本草国药饮片有限公司，批号150319)等12味中药组成，每剂中药总量为122 g，中药材购由福建省医药公司。

1.1.4试剂：DMEM高糖培养基(Hyclone试剂，Cat.# NYE0876)；胎牛血清 (Gibco公司，Cat.# 8122818)；茜素红染料 (Alizarin red)、地塞米松、β-甘油磷酸钠、抗坏血酸磷酸盐均购自美国Sigma公司；碱性磷酸酶测试盒(碧云天，Cat.# P0321)；CCK-8试剂盒(Dojindo, Cat.# CK04)；PI-RNase染色液(BD公司，Cat.#550825)；引物(Takara公司)；荧光定量PCR试剂盒(Takara公司，Cat.# DRR041 A)。

1.1.5仪器：CO2培养箱(Thermo Scientific，型号：HERAcell i)；核酸检测仪Nano2100 (美国Agilent公司)；荧光定量PCR仪7500 FAST(美国ABI公司)；倒置相差显微镜(Leica，型号：DM40000 B)；全波长酶标仪(ThermoFisher Scientific)；流式细胞仪(BD 公司，FACS Calibur)。

1.2 实验方法

1.2.1实验分组及续苓健骨汤含药血清[6]的制备：3月龄SPF级雄性SD大鼠40只，随机分成空白含药血清对照组、续苓健骨汤低剂量含药血清组[6.35 g/(kg.d)]、中剂量含药血清组[12.7 g/(kg.d)]、高剂量含药血清组[25.4 g/(kg.d)]，每组10只。续苓健骨汤的低、中、高剂量组，相当于成人临床用量的0.5、1、2倍。适应性饲养7 d后，按上述剂量进行灌胃给药，每天2次，连续7 d，对照组给予等量生理盐水。末次给药后1 h，腹腔注射戊巴比妥钠30 mg/kg，麻醉。无菌条件下，进行腹主动脉采血5～6 mL。所得血液静置1 h后，3 000 r/min离心l0 min，取上层血清。同组动物血清合并, 56 ℃水浴30 min灭活补体，0.22 μm微孔滤膜抽滤除菌，分装，-20 ℃储存备用。

1.2.2细胞培养：MC3T3-E1细胞系以基础培养基(MEM培养基+10%胎牛血清)培养，隔天换液，取对数生长期细胞用于本实验。根据分组，分别添加体积分数为15%的不含药血清进行干预。

1.2.3CCK-8细胞增殖实验：细胞按2×103cells/100 μL密度接种于96孔培养板，每板设空白孔(仅有培养基，无细胞)，每组设3个复孔。加入不同浓度的含药血清，培养48 h后，每孔加入10 μL CCK8，37 ℃孵育3 h，检测450 nm 波长吸收值。

1.2.4FACS检测细胞周期：取对数生长期的细胞，加入0.25%胰蛋白酶消化后，冷PBS清洗2遍；加入70%的冷乙醇固定过夜；次日加入10 mg/L的RNA酶，37 ℃孵育30 min；加入500 μL PI(50 mg/L)，避光，4 ℃孵育30 min，流式细胞仪检测细胞周期分布，并用ModFit LT V3.0 软件进行细胞周期拟合，得到细胞各个时期的分布状态，计算增殖指数(proliferation index，PI)和S期百分比(S phase fraction，SPF)。公式为：

PI=(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M)×100；SPF=S/(G0/G1+S+G2/M)×100%。

1.2.5ALP活性检测：细胞用成骨诱导剂(50μg/mL抗坏血酸磷酸盐，10 mmol /L β甘油磷酸钠，10 nmol /L 地塞米松) 诱导，每3 d 换液1次，诱导7 d后，收集各组细胞，添加150 μL 0.2% Triton X-100裂解细胞，4 ℃，15 000 r/min离心15 min，收集上清液作为样品；向96孔板内添加50 μL底物、30 μL缓冲液和20 μL样品，在微孔板震荡器上充分振荡1 min后，37 ℃孵育15 min；添加100 μL反应终止液，在微孔板震荡器上充分振荡1 min后，酶标仪测量405 nm处的吸光值；同样方法进行空白(蒸馏水)对照和标准品的检测，实验数据取ALP活性与细胞蛋白总量的比值进行统计分析。

1.2.6茜素红染色及定量：成骨诱导分化14 d，吸走成骨诱导分化完全培养基，用PBS洗2次；每孔加入2 mL 4%中性甲醛溶液，固定30 min；吸走中性甲醛溶液，用PBS洗2次；每孔加入1 mL茜素红染液染3～5 min；吸走茜素红染液，用PBS洗2次；每孔加入 1 mL 10%十六烷基吡啶，轻微摇晃 10 min 洗脱染料，吸取200 μL 加入96孔板中，分光光度计检测 540 nm 处吸光值。

1.2.7实时荧光定量PCR(qRT-PCR)：提取总RNA。定量后，利用反转录试剂盒进行反转录获得定量 PCR模板。引物序列见表1，荧光定量PCR反应体系均如下：SYBR©Premix Ex TaqTMGC 12.5 μL，上下游引物各0.5 μL，dH2O 9.5 μL，cDNA 2 μL，25 μL体系。反应条件如下：①预变性：95 ℃ 10 s，②变性：95 ℃ 5s，③退火、延伸：60 ℃ 31 s，40个循环。采用ABI 7500 Real time PCR仪检测各样本中mRNA的表达情况。以Gapdh作为内参照，每组均做3个重复，取均数。本实验采用2-ΔΔCT法对基因进行半定量分析。

表1 引物序列Table 1 Primers for quantitative real time PCR

1.3 统计学处理

采用SPSS 17.0软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差表示，多组间比较，方差齐的数据采用 One-way ANOVA 检验, 对于方差不齐数据的多组间比较，采用 Kruskal-WallisH检验，如统计具有差异时再以Bonferroni 法进行组间多重比较，定义P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 续苓健骨汤含药血清对MC3T3-E1细胞增殖的影响

我们以不同浓度的续苓健骨汤含药血清干预MC3T3-E1细胞，以空白含药血清组为实验对照，结果表明(表2)，与对照组比较，中、高剂量续苓健骨汤含药血清组能明显促进MC3T3-E1细胞的增殖(P<0.01)，而低剂量续苓健骨汤与对照组比较增殖速度无显著性差异, 呈现出一定的剂量依赖性。

组别48 h(OD450)对照组0.466±0.030低剂量含药血清组0.490±0.014中剂量含药血清组0.730±0.050∗∗高剂量含药血清组0.890±0.180∗∗

注：与对照组比较，**P<0.001。

2.2 续苓健骨汤含药血清对MC3T3-E1细胞周期的影响

流式细胞术检测细胞周期分布，以PI指数和SPF指数表示细胞群体的增殖状态和DNA的合成速度。结果显示：中、高剂量续苓健骨汤含药血清两组的SPF和PI指数均高于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)，而低剂量续苓健骨汤含药血清和对照组比较差异无统计学意义(表3)。

组别SPF指数PI指数 对照组低剂量含药血清组中剂量含药血清组高剂量含药血清组34.62±3.2533.66±1.1536.21±2.26∗36.92±2.17∗50.61±2.1253.17±1.66∗54.57±1.17∗56.28±1.57∗

注：与对照组比较，*P<0.05。

2.3 续苓健骨汤含药血清促进MC3T3-E1细胞的成骨分化

与空白对照组相比，续苓健骨汤含药血清干预7 d，可提高MC3T3-E1细胞合成分泌ALP的活性，且该作用以高剂量组最为显著(P<0.01)，呈现一定的量效关系(图1)。成骨诱导14 d 后，中、高剂量续苓健骨汤含药血清组钙结节的数量和体积明显高于对照组，茜素红半定量结果显示其成骨能力强于对照组，差异有统计学意义(P<0.01)(图2)。

图1 不同剂量续苓健骨汤含药血清对MC3T3-E1成细胞分化能力的影响(**P<0.01)Fig.1 The effect of Xuling strong bone decoction containing serum on the differentiation of MC3T3-E1 cells (**P<0.01)

2.4 续苓健骨汤含药血清对MC3T3-E1细胞成骨分化基因的影响

qRT-PCR结果显示，与空白对照组比较，中、高剂量续苓健骨汤含药血清组成骨分化标志基因Runx2、OC、BMP2、Col1a1mRNA水平明显高于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)(图2)。

图2 不同剂量续苓健骨汤含药血清对MC3T3-E1成细胞分化基因的影响(**P<0.01,***P<0.001)Fig.2 The effect of Xuling strong bone decoction containing serum on mRNAs of the differentiation-related genes of MC3T3-E1 cells (**P<0.01,***P<0.001)

3 讨论

骨质疏松的发病机制是骨形成与骨吸收呈负平衡，从而造成骨重建失衡引起的骨量丢失[7]。成骨细胞在骨重建过程中起关键作用，其数量与功能的变化与骨质疏松症的发生发展直接相关。因此，研究成骨细胞增殖、分化是防治骨质疏松症研究的重要课题之一[8]。本研究结果证实，中高剂量续苓健骨汤含药血清能促进MC3T3-E1 细胞的增殖和细胞周期的进展，并且呈现一定的剂量依赖性。同时，中高剂量续苓健骨汤含药血清能显著上调骨形成相关基因Runx2、OC、BMP2、Col1a1的表达水平，提高碱性磷酸酶活性和促进MC3T3-E1细胞的矿化。说明，在一定浓度范围内，续苓健骨汤含药血清对骨形成具有一定的促进作用。

中医基于 “肾主骨藏精”理论，认为肾精亏虚是骨质疏松症发生的基本病机[9-10]。中医强调根据骨质疏松症的中医证候遣方用药，主要以补肾壮骨、补肾健脾、活血祛瘀理论来指导用药，并从整体方面进行调节[11]。目前研究表明，补肾中药具有促进成骨分化的作用[12]。张晓玮等[13]研究表明，补肾健脾活血中药能够促进成骨细胞表达骨形状发生蛋白的作用，从而能有效提高骨密度。陶乐维等[14]采用中药血清药物化学的方法，发现六味地黄丸对MC3T3-E1细胞有促增殖作用。左归丸在体外可提高MC3T3-E1碱性磷酸酶的活性和矿化能力，从而促进成骨细胞分化[15]。在对其他补肾强骨复方的研究中也发现可以促进骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化[16]。续苓健骨方为课题组葛继荣研究员在中医理论指导下，经过长期临床试验而研发的治疗骨质疏松症的经验方，以补肾壮骨治本。本研究中我们也证实，续苓健骨含药血清在体外能促进成骨细胞的增殖、骨形成和矿化能力。

除了中药复方，单味中药及有效成分的研究也证实补肾中药具有促进骨形成的作用。续苓健骨方以川续断、骨碎补为君药，功取其补肝肾、强筋骨之效。刘介等[17]通过续断总皂甙对成骨细胞的体外培养，发现在一定浓度范围内续断总皂甙可促进成骨细胞增殖、分化和提高细胞增殖指数，可能是该药防治骨质疏松的机制之一。在体外骨髓间充质干细胞诱导为成骨细胞过程中，川续断皂苷可促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞增殖和分化，从而具有促进骨形成的作用[18]。骨碎补含药血清对乳鼠颅骨成骨细胞进行干预后，细胞增殖率、骨钙素分泌量、钙盐沉积量明显增加[19]。刘国岩等[20]研究表明骨碎补可以显著促进大鼠骨髓间充质干细胞的增殖及成骨分化。因此，我们推测续苓健骨方对成骨细胞骨形成的促进作用，与补肾中药川续断、骨碎补的作用机制有关。

本研究发现续苓健骨方在体外具有促进成骨细胞增殖和分化的效应，这对续苓健骨方在骨质疏松症的临床应用及基础研究提供良好的铺垫。由于中医药治疗疾病具有多靶点多方面的优势和特点，强调从整体方面进行调节。续苓健骨方除了补肾治本外，兼有健脾、活血、行气等治则，对于其抗骨质疏松症的其他方面的作用效应及分子机制，还有待进一步的深入研究。