华山壮骨散对激素性股骨头坏死大鼠BMP/Smad/UPP通路的作用机制

黄春元 刘英雪 谢晚晴 蒋宁 林庶茹 郑洪新* 刘海起*

1.辽宁中医药大学附属第四医院，辽宁 沈阳 110101 2.辽宁中医药大学，辽宁 沈阳 110032

糖皮质激素性股骨头坏死(steroid-induced avascular necrosis of femoral head，以下简称激素性股骨头坏死)是由于长期、大量的使用糖皮质激素造成的股骨头缺血性坏死，是临床常见病。根据调查发现，激素性股骨头坏死的发病率在逐年增长，其发病隐匿、进展快、预后差、致残率高[1]。本实验采用华山壮骨散对其进行治疗，华山壮骨散有补益肝肾、活血化瘀的作用，对股骨头坏死的治疗有较好的临床效果，通过检测BMP4、Smad4、Smurf1和Smurf2的表达情况来探讨华山壮骨散防治激素性股骨头坏死的作用机制。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1实验动物：实验选用120只SD雄性大鼠，体质量在(220±20)g，全部由辽宁长生生物有限公司提供，进行随机分组后，将大鼠饲养在SPF级实验室，每笼10只，给予普通饲料喂养，自由饮水，摄食。

1.1.2实验主要试剂、仪器：QUANTITE CTSYBR green PCR kit(沈阳鑫科生物制剂中心)、TRIzol(Invitrogen，Cat no15596-026)、反转录试剂盒(TaKaRa，大连宝生物公司合成)、低温高速离心机(法国Jouan，MR1822)、荧光PCR仪(美国 Agilent Technologies，Stratagene Mx3000P)、微量核酸蛋白检测仪(美国 Bio Drop E114095)。

1.1.3实验药物：华山壮骨散(由九种免煎颗粒组成)，全部由辽宁中医药大学附属第四医院中药局提供，配制成药液4 ℃保存备用；壮骨关节丸，华润三九医药有限公司，规格为60粒/瓶(批号为16030045)；醋酸泼尼松龙注射液，浙江仙居制药股份有限公司(批号为160806)，规格0.125 g/5mL。

1.2 实验方法

1.2.1激素性股骨头坏死动物模型建立与分组：将大鼠适应性饲养1周后，随机分成5组，分别为正常组(A组)、模型组(B组)、壮骨关节丸组(C 组、阳性对照组)、实验低剂量组(D组)、实验高剂量组(E组)，每组各24只。A 组不做任何处理，B、C、D、E组采取臀肌注射醋酸泼尼松龙20 mg/kg，每周2 次；同时，臀肌注射青霉素，每周2 次，预防感染。

1.2.2给药方法：A、B组给予等量生理盐水，C组给予中药壮骨关节丸灌胃治疗，D组给予低浓度华山壮骨散灌胃治疗，E组给予高浓度华山壮骨散灌胃治疗。实验期间每周称重一次，根据体重调整用药量，连续灌胃10周。灌胃结束后取大鼠的股骨头和肾脏保存备用。

1.2.3观测指标：观测大鼠股骨头和肾组织的BMP4、Smad4、Smurf1和Smurf2的mRNA表达情况。

1.2.4标本制备及检测方法：骨组织标本的制备：取大鼠两侧股骨头，放入已装有TRIzol的Ep管内，做好标记，放入-70 ℃冰箱保存备用。肾组织标本的制备：取大鼠肾脏，剥离掉外层薄膜，用刀片将肾脏分为两半，取肾皮质，放入已装有TRIzol的Ep管内，做好标记，放入-70 ℃冰箱保存备用。按照TRIzol试剂说明书采取一步法提取股骨头、肾脏组织中总的RNA。计算样品总RNA浓度，完成股骨头、肾脏组织中总RNA的制备；根据大鼠BMP4、Smad4、Smurf1和Smurf2序列，使用Premier 5.0设计合成了扩增BMP4、Smad4、Smurf1和Smurf2片段的特异性引物(以β-actin基因作为PCR的内参照)，进行引物序列设计(见表1)；再依据反转录反应体系及条件以及PCR反应体系及条件，进行RT-PCR试验。为减少误差，各组BMP4、Smad4、Smurf1和Smurf2的表达水平均以相对表达量来表示[2]。

表1 引物序列设计Table 1 Primer sequence design

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 大鼠股骨头和肾组织BMP4mRNA表达情况

与正常组相比，模型组股骨头和肾组织BMP4mRNA表达量均显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，各组股骨头和肾组织BMP4mRNA表达均有增加，但增加程度有所不同，其中实验高剂量组股骨头和肾组织中BMP4mRNA表达显著增加，差异有统计学意义(P<0.05)；实验低剂量组股骨头和肾组织中BMP4mRNA略有增加，差异无统计学意义(P>0.05)。与壮骨关节丸组相比较，实验高剂量组股骨头和肾组织的BMP4 mRNA表达增加，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

组别股骨头肾组织正常组1.03±0.25Δ∗1.12±0.55Δ∗模型组0.22±0.07#∗0.20±0.07#壮骨关节丸组0.40±0.07#Δ0.32±0.10#实验低剂量组0.28±0.11#0.27±0.08#实验高剂量组0.51±0.06#Δ0.56±0.19#Δ

注：与正常组相比，#P<0.05；与模型组相比，ΔP<0.05；与壮骨关节丸组相比，*P<0.05。

2.2 大鼠股骨头和肾组织的Smad4 mRNA表达

与正常组相比，模型组的股骨头和肾组织Smad4 mRNA表达均有降低，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，各组股骨头和肾组织Smad4mRNA表达均有增加，实验高剂量组股骨头和肾组织中Smad4mRNA表达显著增加，差异有统计学意义(P<0.05)；实验低剂量组股骨头和肾组织中Smad4 mRNA有表达，差异无统计学意义(P>0.05)。与壮骨关节丸组相比较，实验高剂量组股骨头和肾组织中Smad4mRNA表达增加，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3大鼠股骨头和肾组织的Smad4 mRNA表达

组别股骨头肾组织正常组1.04±0.28Δ∗1.03±0.24Δ∗模型组0.06±0.03#0.03±0.02#壮骨关节丸组0.24±0.07#0.20±0.08#实验低剂量组0.11±0.03#0.13±0.09#实验高剂量组0.48±0.16#Δ∗0.63±0.28#Δ∗

注：与正常组相比，#P<0.05；与模型组相比，ΔP<0.05；与壮骨关节丸组相比，*P<0.05。

2.3 各组大鼠股骨头和肾组织的Smurf1 mRNA表达

与正常组相比，模型组的股骨头和肾组织Smurf1mRNA表达量显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，实验高剂量组股骨头和肾组织中Smurf1mRNA表达显著增加，差异有统计学意义(P<0.05)；壮骨关节丸组股骨头中Smurf1mRNA表达显著增加，差异有统计学意义(P<0.05)。与壮骨关节丸组相比较，实验高剂量组股骨头和肾组织Smurf1mRNA表达增加，但在股骨头表达中差异无统计学意义(P>0.05)；在肾组织表达中差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

组别股骨头肾组织正常组1.01±0.17Δ∗1.01±0.15Δ∗模型组0.23±0.08#∗0.22±0.08#壮骨关节丸组0.38±0.05#Δ0.38±0.18#实验低剂量组0.30±0.10#0.33±0.14#实验高剂量组0.46±0.09#Δ0.70±0.17#Δ∗

注：与正常组相比，#P<0.05；与模型组相比，ΔP<0.05；与壮骨关节丸组相比，*P<0.05。

2.4 大鼠股骨头和肾组织的Smurf2 mRNA表达

与正常组相比，模型组股骨头和肾组织Smurf2 mRNA表达量都显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，各组股骨头和肾组织中Smurf2 mRNA表达均有增加，其中，实验高剂量组股骨头和肾组织的Smurf2mRNA表达显著增加，差异有统计学意义(P<0.05)；壮骨关节丸组股骨头中Smurf2 mRNA表达增加，差异有统计学意义(P<0.05)。与壮骨关节丸组相比较，实验高剂量组股骨头和肾组织的Smurf2 mRNA表达增加，差异有统计学意义(P<0.05)。见表5。

组别股骨头肾组织正常组1.01±0.15Δ∗1.03±0.25Δ∗模型组0.04±0.01#∗0.01±0.00#壮骨关节丸组0.15±0.04#Δ0.04±0.01#实验低剂量组0.07±0.04#0.02±0.00#实验高剂量组0.28±0.03#Δ∗0.26±0.14#Δ∗

注：与正常组相比，#P<0.05；与模型组相比，ΔP<0.05；与壮骨关节丸组相比，*P<0.05。

3 讨论

股骨头坏死的病名在古代医籍中没有记载，根据其临床表现，可将其归为“骨蚀” “骨痹”等范畴，其形成主要是由于药邪侵袭股骨，经络气血郁痹，髓减骨蚀所致，内在因素则与肝肾亏虚，筋骨失养有关[3,4]。中医治疗以补益肝肾，活血化瘀为主。华山正骨作为孙华山创始的骨伤科学术流派，在全国骨伤科具有广泛的学术影响。华山壮骨散为孙氏所创，在前期临床实践中疗效显著，其组成主要以矿物质药物自然铜为主，主要功效是散瘀止痛，续筋接骨；佐以相应植物药和动物药如骨碎补、刘寄奴、续断、土鳖虫、地龙等，能更好地发挥治疗作用，但其作用机制尚未明确。

激素性股骨头坏死是股骨头坏死的常见类型，主要由于糖皮质激素使用剂量较大、时间较长，导致骨组织的再生修复能力障碍，股骨头结构改变，股骨头塌陷、变形，关节炎症，功能障碍。有文献指出，骨组织的血液循环障碍可引起骨重建失衡[5]。

在股骨头坏死的修复过程中，BMP/Smad/UPP通路起着关键作用。BMP4是TGF-β超家族中的重要成员之一，其结构和功能与BMP2相似，可以诱导相关骨组织的形成, 有助于骨组织的修复，是骨在发育过程中不可缺少的关键因子[6]。Smad通路主要的功能是传递TGF-β超家族中的信号，Smad蛋白是BMP的下游信号转导因子[7-8]，目前根据Smad蛋白的结构和功能可将其分为三类：特异型、共有型和抑制型。其中Smad4蛋白属于共有型，其功能较为重要，调控着TGF-β超家族的所有因子在细胞内的信号转导途径，是BMP2诱导成骨细胞形成的关键蛋白[9]。特异性降解细胞内Smads蛋白的是泛素-蛋白酶体通路(ubiquitin-proteasome pathway UPP)这主要途径，Smurf1和Smurf2属于泛素连接酶E3的成员，可以选择性降解Smad蛋白和调控BMP的信号转导，进而影响成骨细胞的增殖和分化[2]。

本研究结果表明，正常大鼠体内的BMP4、Smad4、Smurf1和Smurf2可以在基因水平正常表达。在注射糖皮质激素以后，其表达受到影响，造成大鼠的股骨头不能正常发育，逐渐形成激素性股骨头坏死。中药复方华山壮骨散可以调节模型大鼠股骨头和肾脏中BMP4、Smad4、Smurf1和Smurf2的基因表达，与模型组相比，经过实验高、低剂量组治疗后，均可以提高模型大鼠的BMP4和Smad4的表达。与实验低剂量组相比，高剂量的华山壮骨散可以明显促进模型大鼠BMP4和Smad4的表达，加快骨细胞生成，促进骨质形成，修复骨损伤，从而延缓激素性股骨头坏死的形成。

由于股骨头坏死的修复机制非常复杂，其治疗方法多样化，但对于大多数人来说人工置换股骨头并不是最好的选择，寻找新药、新技术来治疗股骨头坏死刻不容缓。华山壮骨散治疗股骨头坏死的疗效确切，作用机制明确，便于临床使用。但其作用的具体机制还需做进一步深入探讨，才能更好的为临床防治股骨头坏死提供实验依据，开拓新的治疗药物。