中山大学附属第五医院生物样本库的建立与完善

张文凯，梁丽琪，孙伟铭，黄晓芳

技术与方法

中山大学附属第五医院生物样本库的建立与完善

张文凯，梁丽琪，孙伟铭，黄晓芳

生物样本库即标准化收集、处理、保存和使用各种离体生物样本和表型信息，为生物医学研究提供科研材料的资源库[1]。生物样本库涵盖了丰富的疾病临床信息与样本生物学信息，为疾病的研究、遗传和健康事业发展提供了战略性资源，是支撑转化医学和精准医疗实施的前提，更是研究型医院与学科建设的基石。

欧美国家非常重视生物样本库的建设，1999 年英国建立的生物信息库（UK Biobank）是目前世界上最大的医疗资料数据库；2005 年美国国立癌症研究所成立了美国国家癌症中心生物样本库和生物样本研究办公室（Office of Biorepository and Biospecimen Research，OBBR），率先推动了生物样本库的规范化建设。近十年来，随着我国政府、医院和各大研究机构对生物样本库的关注，国内大型城市陆续建立起各自的生物样本库：北京市建立了脐带血造血干细胞库，深圳市建立了华大国家基因库······这些样本库的建立和发展为研究疾病的发生、发展与转归提供了良好的资源平台。

随着粤港澳大湾区一体化进程的加速，广东省积极推动生物样本库的建设。中山大学附属第五医院作为大湾区西岸的大型三甲综合医院，拥有丰富的疾病样本资源，并与华大基因携手共建“中大五院-华大联合实验室”，致力于降低出生缺陷，加强肿瘤防控，助力精准医学。为落实国家生物医学发展的长期规划，我院积极筹备建设高质量的生物样本库，以期实现对生物样本、临床资料等资源的高效利用，促进临床、科研和教学工作。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 场地 生物样本库建设面积达 500 余平方米，由医院统一设计、规划和管理，各科室经由规范化的程序可共享样本资源。样本库设有办公室、档案室、前处理室、综合处理室、超低温冰箱库和液氮库六个功能区，预计存储规模达 300 万份以上。

1.1.2 主要设备耗材 B2 生物安全柜购自广州杉利贸易有限公司；Eppendorf 5810R 台式冷冻离心机购自广州市元晞生物科技有限公司；DW-86L829BPT 超低温立式冰箱购自海尔集团；全自动磁珠提取纯化系统和超微量分光光度计购自广东丹利科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 组织架构 生物样本库组织架构由学术委员会、伦理委员会和执行机构三部分组成。执行机构由样本库主任负责统筹管理，下设数名专职技术员，负责样本库日常运行和维护工作。技术员需接受专门培训，熟悉操作规程、样本处理和手术取材等。

1.2.2 收样方式 我院采用以非选择性连续收集和以项目为导向的样本收集两种方式。非选择性连续收集即在医院相关政策的推动下，对新入院患者非选择性地收集各类型的生物样本（需与患者签订知情同意书）；以项目为导向的样本收集需经学术委员会和伦理委员会的审查。对于无项目导向计划的科室，执行非选择性连续收样，即对新入院病人均采集血样样本；对于手术病人，均留存组织样本。对于有项目导向的科室，按项目导向要求进行样本采集。

1.2.3 血液标本的采集和处理 医生对患者进行评估，若符合入组标准，医生在 HIS 系统中开立“样本库留样”医嘱和“样本使用告知书”，护士执行采血；根据科室需要，可采集抗凝血或促凝血（2 ~ 3 ml/管），并及时暂存至 4 ℃冰箱；随后冰盒运输至样本库。

血液标本从采集到入库的处理时限为 4 h。样本库人员收到血样后，扫描采血管上条形码进行样本接收、模板分装、预打印标签等线上操作，打印并粘贴样本标签；后对样本进行离心分装处理（离心参数：4 ℃，1600 ×，10 min），根据实际分装样本数量执行入库操作，并存于–80 ℃冰箱。

1.2.4 组织标本的采集和处理 组织标本的采集应在满足临床病理诊断的前提下，由样本库进行采集和储存。组织取材者通过样本库管理系统，提前获知手术科室留样需求及手术排班，并预打印出样本标签，粘贴于冻存管上。组织离体后应尽快处理，取材部位包括肿瘤组织、癌旁组织和正常组织，取材应按照“正常-癌旁-肿瘤”的顺序，以癌灶为中心水平向两侧取材，尽量保证组织样本足够大[2]；取材完成后，将样本切割成大小约为 0.5 cm3的小块，装于对应冻存管中，快速置于便携式液氮罐里，随后转移至–80 ℃冰箱长期保存。需注意：①组织从离体到冻存应在 30 min 内完成，②取不同患者样本时，应更换刀片和器械。

1.2.5 尿液标本的采集和处理 采样流程及入库操作参考 1.2.3，采集的尿样暂存于 4 ℃冰箱。样本库人员收到尿液标本后轻摇观察，如尿样浑浊，应离心除去可见杂质（离心参数：4 ℃，400 ×，15 min），离心后分为尿液上清和尿液沉淀两部分，分开保存；如尿样澄清，颠倒混匀后即可分装[3]。尿液标本从采集到入库的处理时限为 2 h，样本分装后存于–80 ℃冰箱。

10月21日，由吉林省农业农村厅、吉林省人民政府驻北京办事处、北京市农村工作委员会共同主办的“吉优农品·誉满京城——2018吉林省优质特色农产品大型宣传推介活动”在北京举行，来自吉林省的60余家涉农企业、200多种优质特色农产品集中亮相展示。

1.2.6 样本的信息化建设 样本库信息化建设包括：①样本管理；②供体管理；③储存管理；④质控管理；⑤出库申请；⑥科室出库审批；⑦随访管理；⑧试剂耗材；⑨统计查询等内容。我院定制开发的样本信息管理系统可与医院信息管理系统（HIS）、手术室麻醉信息系统（AIMS）、实验室信息管理系统（LIS）、电子病历（EMR）等数据端口对接，将上述临床诊疗信息和样本生物信息进行一体化整合，通过自动获取并存储预设的临床信息字段，生成样本标签，实现样本信息的可视化和可追溯性管理。

1.2.7 质量控制 包括对样本的储存状态、临床信息和生物信息的核查和监测。我院生物样本库主要采用随机抽样方式，每季度对新入库样本的 5% 进行信息质控，每半年对在库样本的 5% 进行生物学质量检测，并形成各类质控报告[4]。对于不合格样本，执行废除出库。

2 结果

2.1 建立标准化样本操作流程

标准化、规范化的样本操作流程，是维护高质量样本的保障，也是样本库实现共享与利用的前提。我院前期通过实地调研、参观国内成熟样本库的管理模式，并参照国内外权威样本库的建设与实践指南[5]，建立起一套涵盖样本采集、处理、存储、使用、质控等各个环节的操作流程[6]（图 1）。

2.2 样本收集情况

生物样本库于 2018 年 8 月开始面向全院收集样本，目前共存放各类样本 8987 份，捐赠者人数 1729 例，其中血液样本 8511 份（包括全血、血浆、白膜层、血细胞、血清、血凝块、PBMC 等不同成分）、组织样本 424 份、尿液样本 52 份；存样科室涵盖神经内科、肿瘤科、泌尿外科等 14 个科室（图 2）。

2.3 样本质控情况

2.3.1 样本信息质控 样本库信息管理系统设置权限分配，确保信息安全和捐赠者的隐私保护。为提高样本信息的真实性、完整性、实时性，工作人员对新进样本执行季度性信息核查：由系统随机选取新进样本的 5%，核对样本的标签信息、存储位置等是否与信息系统中的记录相一致；核查样本相关的处理信息、临床信息、随访信息等是否齐全。

图 1 生物样本库操作流程

图 2 2018年8月– 2019年4月样本库收样情况（*表示该时期内，肾内科转入生物样本库 876 例病人共计 4940 例血液样本）

2.3.2 样本质量检测 指从病理状态、分子水平和其他特定指标等对样本进行评价。组织或血液样本最好的质控指标是检测 DNA、RNA 和蛋白的质量[7]。

2.3.2.1 血液样本质控 通过从血样本中提取 DNA、RNA 或蛋白质，检测其纯度和完整性。抗凝血中的白膜层和促凝血中的血凝块是体细胞核酸的主要来源。用全自动磁珠提取纯化系统，提取样本中的 DNA/RNA，用超微量分光光度计检测 DNA/RNA 的浓度，通过260/280判断核酸的纯度，比值在 1.8 ~ 2.2，表明核酸较纯。对提取的 DNA/RNA 进行 1% 琼脂糖凝胶电泳，DNA 电泳出现一个清晰条带且分子量较大，提示样本 DNA 完整性较好；RNA 电泳出现清晰的 28 S 和 18 S 条带，且 28 S 条带亮度约是 18 S 的两倍，提示样本 RNA 完整性较好[8]。也可用生化分析仪直接读取样本的 RIN 值（RNA integrity number，RIN）来评估 RNA 的完整性[9]。

样本蛋白质质量评估主要从浓度与完整性两方面考虑。Georgiou 等[10]报道考马斯亮蓝法是目前检测蛋白质灵敏度最高的方法。蛋白与染料结合后，通过读取样本在 595 nm 的吸光度表征蛋白质浓度，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳上条带数目、清晰度和条带分子量，评估蛋白质的完整性。

2.3.2.3 随机抽样质控结果 通过随机抽取不同时期收集的血液样本，提取总 DNA 进行纯度和完整性检测，以评估此阶段样本的存储质量。用超微量分光光度计读取样本260/280，比值均在 1.8 ~ 2.2（表 1）；对总 DNA 进行 1%琼脂糖凝胶电泳，结果如图 3，各样本 DNA 电泳条带清晰，完整性良好。上述结果表明，我院样本库建立的操作流程可靠，能够为基础和临床科研提供合格样本。

表 1 样本库随机样本的 DNA 纯度检测

图 3 样本库随机样本的 DNA 电泳图

2.4 样本数据返还

数据返还有助于样本库管理人员更加全面、有效地掌握存储样本的质量信息和应用价值。样本使用者在样本出库后一定期限内，执行样本数据返还，返还的数据有：①样本的质控数据：包括样本的深加工产物，如 DNA、RNA、蛋白的浓度、纯度、完整性等参数，以及切片的病理学评价指标如“肿瘤百分比”等；②样本的研究数据或成果：包括利用样本进行研究得到的研究结果、可以共享的一些分子标记物、发表的文章、完成或申报的课题、获得的专利及研发的产品等；③样本返还：样本出库使用后，若样本仍有剩余且样本质量良好，应再行入库附加至库存样本，以支持二次利用，提高样本价值。

3 讨论

3.1 生物样本库建设意义

随着大数据时代的来临，建设开放共享的生物样本库，是实现重大课题的多中心合作研究和区域生物样本库网络化融合的必然要求，也是样本库发展的整体趋势和理想方向[12]。美国 Anderson 癌症中心建立的胰腺癌组织库，下设 25 个卫星组织库，形成了完备的生物信息网[13]；国内在上海市建立的“临床与生物样本信息整合平台”对促进上海的转化医学研究有巨大的推进作用。

粤港澳大湾区人口基数庞大，外来人口增长迅速，疾病背景和遗传资源多样，同时拥有岭南地域特性，为建设标准化、开放共享的生物样本库奠定了良好基础。我院地处大湾区西岸核心城市，毗邻港澳，依托于大湾区强大的人口基数和地理优势，我院建设的生物样本库，可在较短时间内积累大量样本，并为特种病（鼻咽癌、食管癌等）、罕见病的医学研究提供样本储备。利用本样本库资源，2018 年，Pang等[14]在上首次发现并命名了多器官静脉-淋巴管畸形综合征。建设高水平的生物样本库，对粤港澳大湾区的生命科学研究和生物医药发展，以及提高我院承担区域及国家重大科研项目的能力有着深远意义。

3.2 现阶段运行困难及解决方案

综合型生物样本库的建设是一个系统化工程，需要统筹和调动医院各个科室的力量。我院生物样本库在建设初期遇到的困难主要有：①临床重视度不够、前瞻性欠佳。部分临床科室习惯于随机收样，样本质量参差不齐。我们通过不断推广样本库的开放共享理念，将医院散乱的样本库高效整合，统一管理；并建立以科主任为主要负责人，包括手术医生、护士在内的样本收集任务，鼓励各科室建立“课题导向的子样本库”，大大提高了临床科室留样的积极性。②收样流程不规范。在初始收样阶段，由于临床医护人员不熟悉样本收集流程，常出现知情同意书的漏签、样本运送延迟等问题；通过关联 HIS 系统，将知情同意书抓取到样本信息管理系统，并不断优化收样流程，这些问题得以改善。

3.3 生物样本库的机遇与挑战

2016 年，我国正式启动精准医疗计划，旨在筹建人类遗传资源库、国家生物信息中心等核心平台，生物样本库迎来了快速发展的黄金时代[15]；2019 年，国务院出台《粤港澳大湾区发展规划纲要》，全力打造国际一流湾区。作为大湾区西岸的核心医院，我院同时也是国际医疗救援的定点单位和西岸最大的感染病治疗专区。建设规范化、高质量的生物样本库，将打破粤港澳地区医疗发展种种壁垒，汇集香港、澳门以及外籍居民丰富的疾病谱，为广泛开展不同人种的大规模组学研究、前瞻性队列研究等提供大数据样本资源。

在快速发展的同时，我院样本库建设也面临着一些挑战：①可持续发展受限。目前样本库的建设资金主要来源于医院扶持，投入大、产出少、缺乏资源有偿服务机制。为解决这一问题，政府需做好顶层设计，给予政策和经费支持；医院也应与科研机构、高新企业等积极探索联合共建模式，开发资源平台的自我造血功能。②捐赠者认知度不足。相较于国外，我国民众对于生物样本捐赠的总体意愿较低，严重制约生物样本库的规模发展[16]。基于此，我们应加强伦理法规建设，并通过媒体宣讲、地区走访等途径，普及民众对生物样本使用和临床研究意义的认知。

综上，本研究初步建立了一个规范有效的生物样本库。未来，我们希望能拓宽样本渠道，争取纳入更多珠三角地区医院的疾病样本而形成更大的样本资源平台；进一步完善样本的信息化管理系统，实现信息数据的高效录入、安全存储、互惠共享等；争取将我院样本库建设成为一流的生物样本资源与转化医学高地，并助力粤港澳大湾区精准医学研究和医疗健康发展。

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519000 珠海，中山大学附属第五医院广东省生物医学影像重点实验室

黄晓芳，Email：huang20180101@outlook.com

2019-08-07

10.3969/j.issn.1673-713X.2019.06.017