结肠直肠癌早期诊断中DNA甲基化检测的研究进展

胡育铭， 郑 阔 综述 于冠宇， 张 卫 审校

（1.海军军医大学附属长海医院肛肠外科，上海 200433；2.海军军医大学基础医学院，上海 200433）

结肠直肠癌（colorectal cancer,CRC）是最常见的胃肠道恶性肿瘤。每年全世界新发CRC150万例[1-2]，在恶性肿瘤发生率位于第3位。每年死于CRC例数约60万，在癌症死因中占第3位[2]。在全球范围内，CRC的发病率和病死率仍进一步升高。CRC起病隐匿，进展较快，病人预后与明确诊断时的临床分期密切相关。2015年我国癌症统计数据显示：我国CRC发病率、死亡率在全部恶性肿瘤中均居第5位。其中新发病例37.6万，死亡病例19.1万。城市地区远高于农村，且结肠癌的发病率上升显著。多数病人发现时已属于中、晚期[3]。文献报道，Ⅰ期CRC病人的5年生存率高于90%，而Ⅳ期CRC病人低于10%[4]。因此CRC的早期诊断对于降低CRC的病死率意义重大。

CRC现有筛选手段及特点

一、全结肠镜/乙状结肠镜检查

全结肠镜/乙状结肠镜（肠镜）检查因其高度的灵敏度和特异度已成为普通人群中CRC早期诊断的主要手段[5-6]，但肠镜的推广仍受一些因素的制约。一方面，肠镜作为一种侵入性的检查手段，在检查过程中会引发较大的不适感，且可能造成出血、穿孔等并发症发生[6]，限制病人对于肠镜的接受程度。另一方面，肠镜因其花费的医疗资源相对较多，不适合作为CRC大规模早期筛查的方式。

二、大便隐血实验

大便隐血试验（fecal occult blood test,FOBT）也是CRC常见的筛查手段[7]。FOBT优势在于相较于肠镜检查，其极易完成，几乎无任何风险，所占用的医疗资源较少。但FOBT的不足也很明显，饮食、结肠炎，痔疮以及温度均能严重影响其特异性[8]。因此，FOBT不能作为单独筛选检查手段。检查阳性结果的病人仍需行结肠镜检查[9]。

三、血清肿瘤标志物检测

目前用于临床检测的血清肿瘤标志物 （tumor marker,TM）主要为表型标志物，包括CEA、CA19-9等。 但目前临床上用于检测的TM特异度和灵敏度仍待进一步提高。如CEA升高不仅见于肿瘤，在结肠息肉、肝硬化、慢性肝炎、心血管疾病以及糖尿病病人也会升高[10]。因此，临床上此类肿瘤标志物常用于术后CRC的复发检测指标。

近年来，游离DNA在CRC早期诊断中作用的研究逐步开展，有望成为一种新型的血清肿瘤标志物。游离DNA是一种主要存在于血液、滑膜液和脑脊液等体液中的胞外DNA，普遍认为主要来源于凋亡坏死的细胞。研究表明，在乳腺癌、肺癌、食管癌等多种肿瘤病人体内，游离DNA的浓度以及完整性与正常人群存在显著差异，并对预后判断有很大的参考价值[11-12]。在早期诊断CRC的传统方式存在许多不足的背景下，游离DNA可能成为鉴定微小残留疾病、评估治疗反应和预后以及鉴定耐药机制有希望的方式之一[13]。可在病人的血液和粪便中找到CRC细胞来源的异常甲基化DNA，且有证据表明血液DNA甲基化可反映肿瘤组织的甲基化程度[14]。但是，由于血清中cfDNA（cell free DNA）的含量很低，其完整性又受到很多因素的影响。因此，游离DNA的检测内容仍有待完善，其中检测游离DNA甲基化状态有望成为CRC早期诊断的理想手段。

DNA甲基化及其作为CRC早期诊断标志物的可行性分析

一、DNA甲基化

DNA甲基化是真核生物表观遗传修饰的重要方式之一，其可发生在染色体DNA和组蛋白上。DNA甲基化的部位包括启动子、基因本体等。目前研究认为，启动子的DNA甲基化能抑制基因的表达，而基因本体的甲基化对基因本体的影响可能不大[15]。启动子的DNA甲基化主要发生在CpG序列的部位，即CpG岛。当CpG岛上的胞嘧啶C发生甲基化后，其能通过与转录因子结合或改变染色体的结构等机制抑制基因转录[16]，能稳定存在于DNA复制期间，并遗传给子代。

二、DNA异常甲基化参与CRC的发生和发展

CRC的发生是一个多阶段多步骤的过程。目前公认的大多数CRC发病模式为正常黏膜异常隐窝病灶（abnormal crypt foci,ACF）-腺瘤-恶性肿瘤。多种癌基因的突变和抑癌基因的失活是CRC发生的分子基础[17-18]。这一过程由突变和表观遗传改变的积累驱动，需10～15年才能发生。但在某些情况下可更快地发展，如Lynch综合征病人。直到5～10年前，管状和管状绒毛状腺瘤性息肉仍被认为是唯一能进展为癌症的病变[19]。散发性CRC约占所有CRC总数的85%[20]，其发生、发展涉及的基因数目较多，提示其发生的必要条件可能是基因组不稳定[21]。在CRC中，发现异常DNA甲基化涉及许多基因，如DNA错配修复基因 （mismatch repair,MMR）、WNT信号通路基因和细胞周期调控基因。 具有广泛甲基化CRC的子组被称为CIMP+[22]。目前研究表明，两种基因组的不稳定途径参与CRC的发生：微卫星不稳定途径和染色体不稳定途径[23-24]，而两种途径都与DNA异常甲基化有关。

DNA异常甲基化导致染色体不稳定性。染色体不稳定性主要是指染色体的形态、结构和倍体类型发生改变。研究表明，在CRC发生过程中，染色体不稳定性是最常见的现象，并与细胞的异常增殖、侵袭有关[25]。染色体不稳定的重要机制是一系列抑癌基因（GATA4、GATA5、p16等）的启动子片段甲基化异常升高，从而导致染色体丢失或增加[26-27]。

DNA异常甲基化与微卫星不稳定途径。微卫星不稳定能反映胞内MMR功能缺陷。在散发性CRC中，MMR基因（主要是 MLH1、MSH2、MSH6和 PMS2）功能缺陷的重要机制并非本身突变，而是其启动子序列上CpG岛发生过度甲基化，从而使基因转录受到限制而导致MMR蛋白无法表达[28-29]。

三、游离DNA中异常甲基化片段检测的技术可行性

在CRC细胞发生、发展中，部分肿瘤细胞会发生凋亡坏死，释放出DNA进入循环。通过一定的技术手段对循环中游离DNA片段进行检测，有望发现异常甲基化片段，实现对CRC的早期诊断。

常规的甲基化特异性聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）非常敏感，但结果却呈现高假阳性和假阴性，且只能定性地来解释结果。这些原因都限制其临床应用[30]。基于定量甲基化特异性PCR（荧光法、SMART-甲基化特异性PCR等）的方法提供更易选择的甲基化阈值，且避免识别不完全重亚硫酸氢盐转化假阳性结果的机会。其他方法包括甲基化阵列、DNA阵列、表面增强拉曼反射和限制性片段长度多态性等[31]。另一个“数字化”的方法，被称为“甲基化-Beaming”技术，被Li等[32]研究证明，可用来针对血液中少量的环状DNA对癌症衍生的波形蛋白DNA进行数字量化。Leary等[33]研究针对以前的方法无法重复和灵敏度不高等缺陷提供理想的结果。使用高通量测序技术方法区分CRC病人晚期与健康人对照的研究取得了令人鼓舞的结果。高通量测序技术具有高灵敏度，并覆盖CRC早期检测基因组的大片区域。

循环DNA甲基化检测在CRC早期检测的相关研究

一、单基因检测

SEPT9基因用于循环DNA甲基化检测。SEPT9基因参与细胞增殖控制。在CRC中，SEPT9的V2启动子区域异常甲基化。Grützmann等[34]研究表明，在 CRC病人血浆中SEPT9基因检出的灵敏度72%、特异度90%。最近，Church等[35]进行一项前瞻性试验。研究纳入7 941例无症状个体，分析筛查期间的SEPT9甲基化的情况。结果显示，具有该基因甲基化的个体中，CRC检出率高达48.2%，特异度高达91.5%。Fu等[36]研究显示，手术后7～14 d血浆SEPT9甲基化的持续阳性与发生1年内复发或转移高度相关，灵敏度100%。随访期间术后SEPT9甲基化状态也为CRC复发或转移提供有价值指标，揭示其在评估CRC疗效和监测CRC复发或转移中的重要作用。显然，检测SEPT9甲基化的方法需进一步改进，以提高其检出率。

二、多基因联合检测

研究表明，对多个基因甲基化检测的组合分析可使CRC的检测率更高。根据Ladefoged等[37]研究，对193例CRC病人和102例结肠镜检查健康的对照进行横断面病例对照研究显示，单个高甲基化DNA启动子区域作为CRC筛选标志物价值有限。然而，一组7个高甲基化启动子区域作为CRC检测的模型显示出广阔的应用前景[37]。Alhquist等[38]研究发现，与使用SEPT9（灵敏度60%）早期诊断检测CRC相比，使用骨形态发生蛋白（BMP3）、N-myc下游调节家族成员（NDRG4）波形蛋白、组织因子途径抑制剂 2（TFPI2）、突变型KRAS和β-肌动蛋白等甲基化基因的组合，灵敏度可达87%。Symonds等[39]用数字PCR测定来测量肿瘤组织DNA中 5个癌症特异性甲基化基因座（EYA4、GRIA4、ITGA4、MAP3K14-AS1和MSC）的甲基化，检测到至少一种标志物中的甲基化（85.7%）。且得出这5种基因联合甲基化监测可用于避免病人特异性突变的缺失及不同治疗方案中监测转移性CRC病人疗效的结论。根据Carmona等[40]研究，当联合AGTR1、WNT2、SLIT2时，CRC的早期诊断灵敏度可达78%。此外，Cassinotti等[41]展示了一些基因组合的潜在应用价值，包括D型细胞周期蛋白基因、肿瘤高甲基化-蛋白1（HIC1）PAX5、Ras相关结构家族 1、信号转导通路基因（RASSF1A）、视网膜母细胞瘤肿瘤抑制因子和绵羊红细胞，其诊断灵敏度达84%，特异性达68%。综上所述，通过游离DNA中多基因异常甲基化的检测，有望实现CRC早期诊断体系的建立。

挑战与前景

一、循环DNA甲基化检测面临的挑战

尽管循环DNA甲基化检测在CRC早期诊断中已展现独特优势，但仍有许多因素限制其在临床上广泛应用。其中，游离DNA含量较低，不易检测一直以来都是难以解决的问题。尽管CRC病人体内的游离DNA含量高于正常人，但在许多病理状态下，如炎症、创伤等，游离DNA的含量仍会明显升高[42]。这就对游离DNA分离技术提出更高的要求。因此，也就可能增加游离DNA检测的成本。此外，在对病人行游离DNA甲基化检测的过程中，血液标本的采集、保存和处理流程仍有待进一步规范。研究表明，抽血和离心的间隔时间、样本的储存模式、使用的抗凝剂种类及温度和血浆DNA的分离方案对于循环DNA分析的效率和质量都具有一定影响[43]。

二、循环DNA甲基化检测的应用前景

在传统的CRC早期诊断方式存在着诸多不足的背景下，通过检测病人血液中游离DNA甲基化状态，实现疾病的诊断无疑是一种理想的检测手段。尽管面临诸多不足和挑战，但不可否认，循环DNA甲基化检测用于CRC早期诊断在已有的研究中已展现很好的应用前景。通过对检测技术的改进更新、多基因联合检测以及确立规范化的检测流程，有望提高临床推广的可行性。