内皮特异性分子1在头颈鳞癌中的表达及临床意义

李群 周重昌 裘世杰 叶栋 邓红霞 沈毅 沈志森

头颈部肿瘤最常见的病理类型为鳞状细胞癌[1]，其发生率和死亡率在全球范围内逐年升高[2]。由于头颈鳞癌早期临床症状不典型，大部分患者诊断时已发生淋巴结转移并成为进展期恶性肿瘤。因此，寻找一种能早期筛查或诊断头颈鳞癌的分子标志物是提高患者远期生存的关键。内皮特异性分子1（endothelial specific molecule 1，ESM1）属于蛋白聚糖家族，在内皮细胞中广泛表达。研究表明，ESM1能促进内皮细胞迁移，从而促进新血管生成[3]。亦有研究表明，ESM1在肿瘤生长、发育和血管形成中发挥着重要作用[4]。目前已有研究表明，ESM1表达会影响结直肠癌、胃癌、鼻咽癌、肝细胞癌的增殖和转移[5-8]。但关于ESM1在头颈鳞癌中的作用尚未阐明。因此，本研究充分利用公共数据库探索ESM1在头颈鳞癌中的临床应用价值，并结合患者生存数据分析ESM1表达对头颈鳞癌患者预后的影响，同时探讨ESM1在辅助诊断头颈鳞癌中的价值，现将结果报道如下。

1 资料和方法

1.1 组织标本收集 选取2017年5月至2018年6月在本院接受手术治疗的头颈鳞癌患者49例，均经组织病理学确诊，术前均未接受放化疗。取49例头颈鳞癌组织及癌旁正常组织，立即存入液氮，并及时转入-80℃冰箱保存。本研究经医院医学伦理委员会审查通过，所有患者签署知情同意书。

1.2 ESM1 mRNA表达水平检测 （1）RNA提取和逆转录：应用Trizol试剂（美国Invitrogen公司）提取49对头颈鳞癌组织及癌旁正常组织标本的总RNA。应用 Go－Script逆转录试剂盒（美国Promega公司）对总RNA进行逆转录反应，获得cDNA。（2）RT-PCR：使用Roche公司 RT-PCR 仪（Light Cycler480），反应体系由 2×SYBR Green荧光染料、DNA聚合酶、PCR缓冲液、上下游引物和模板cDNA构成。以人GAPDH管家基因为内参基因，标准化目标cDNA的量。PCR反应条件：95℃预变性5min，95℃变性 30s，72℃退火 40s，72℃延伸 5min，循环42次。引物信息如下：ESM1正义5′-GGTGGACTGCCCTCAACACT-3′，反义 5′-AAGGTGCCGTAGGGACAGTCT-3′；GAPDH 正义 5′-GGGAAGGT-GAAGGTCGGAGT-3′，反义 5′-GGGGTCATTGATGGCAACA-3′[9]。每个样本针对ESM1和GAPDH检测均重复3次。样本ESM1 mRNA 相对表达量=2-（Ct样本-Ct内参）。

1.3 生物信息资源及分析 从肿瘤基因组计划（TCGA）数据库下载111例头颈鳞癌组织及12例对照组织的全基因组表达数据（HTSeq-FPKM level 3）。应用R软件limma模块分析头颈鳞癌中差异表达基因（差值≥2或＜-2且错误发现率＜0.05），最终确定差值最显著的ESM1为研究目的基因。从基因表达谱动态分析（GEPIA）数据库（http://gepia.cancer-pku.cn）下载 519例头颈鳞癌组织及44例正常组织的ESM1表达、临床分期及生存的数据，分析ESM1在头颈鳞癌组织中的表达及其与患者预后的关系[10]。

1.4 基因富集分析 根据TCGA数据库头颈鳞癌样本ESM1表达的中位数分为ESM1高、低表达组。应用GSEA软件分析ESM1参与头颈鳞癌进展的潜在信号通路。

1.5 统计学处理 应用SPSS 18.0统计软件。头颈鳞癌组织与其对应的癌旁正常组织ESM1表达水平比较采用配对样本t检验；不同临床分期患者头颈鳞癌组织ESM1表达水平比较采用单因素方差分析。利用Kaplan-Meier法绘制ESM1高、低表达的头颈鳞癌患者总生存期及无病生存期的生存曲线，采用log-rank法比较生存率。绘制ROC曲线分析ESM1表达检测对头颈鳞癌的诊断效能。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TCGA数据库头颈鳞癌差异表达基因的情况 对TCGA数据库中111例头颈鳞癌组织及12例对照组织的HTSeq-FPKM level 3全基因组数据进行差异表达基因分析，结果显示头颈鳞癌中有928个基因表达水平明显低于对照组织，1 304个基因表达水平明显高于对照组织，其中ESM1的表达差异最明显，见图1。

图1 TCGA数据库中头颈鳞癌差异表达基因的火山图

2.2 头颈鳞癌组织与癌旁正常组织ESM1表达水平比较 对GEPIA数据库519例头颈鳞癌组织与44例癌旁正常组织中的ESM1表达水平进行比较，结果发现ESM1在头颈鳞癌组织中的表达水平明显高于癌旁正常组织（P＜0.05），见图2a。为进一步验证结果，笔者收集并检测了49对头颈鳞癌组织及其癌旁正常组织的ESM1表达水平，结果证实ESM1在头颈鳞癌组织中的表达水平明显高于其对应的癌旁正常组织（P＜0.05），见图2b。

2.3 不同临床分期患者头颈鳞癌组织ESM1表达水平比较 对GEPIA数据库519例不同临床分期患者头颈鳞癌组织ESM1表达水平进行比较，差异有统计学意义（P＜0.05），见图 3。

2.4 ESM1高、低表达头颈鳞癌患者总生存期和无病生存期比较 根据ESM1表达的中位数，将GEPIA数据库头颈鳞癌组织样本分为ESM1高表达组256例与ESM1低表达组259例，绘制ESM1高、低表达头颈鳞癌患者总生存期及无病生存期的生存曲线，结果发现ESM1高表达组无病生存期高于ESM1低表达组（P＜0.05），ESM1高、低表达组总生存期比较差异无统计学意义（P＞0.05），见图 4。

图2 头颈鳞癌组织与癌旁正常组织ESM1表达水平比较

图3 不同临床分期患者头颈鳞癌组织ESM1表达水平比较

2.5 ESM1高表达在头颈鳞癌中的基因富集分析 在明确ESM1与头颈鳞癌预后有关后，进一步分析ESM1促进头颈鳞癌发生、发展的可能机制。以KEGG参考基因集作为参考基因，对ESM1进行GSEA分析，结果显示ESM1高表达的头颈鳞癌样本主要富集在MAPK信号通路、TGF-β信号通路等，提示ESM1可能通过上述信号通路参与头颈鳞癌的发生、发展，见图5（插页）。

图4 ESM1高、低表达头颈鳞癌患者总生存期和无病生存期比较（a：总生存期；b：无病生存期）

图5 ESM1高表达在头颈鳞癌中的基因富集分析

2.6 ESM1表达检测对头颈鳞癌的诊断效能 49对头颈鳞癌验证样本中，ESM1表达检测诊断头颈鳞癌的AUC为0.96，灵敏度为0.918，特异度为0.939，见图6。提示ESM1可成为辅助诊断头颈鳞癌的分子标志物。

3 讨论

肿瘤的发生、发展和转移是涉及多步骤、多基因的复杂过程。从基因水平研究肿瘤发生、发展和转移等过程中基因谱变化，能为肿瘤早期诊断、治疗方案的确定及预后判断提供帮助。随着肿瘤分子机制研究的不断深入，目前已证实血管内皮细胞在上述变化过程中发生着功能和结构的变化。血管内皮细胞能被多种由肿瘤细胞分泌的细胞因子激活，形成癌栓；亦可被肿瘤细胞分泌的蛋白溶解酶破坏内皮结构，从而导致肿瘤细胞浸润利于转移；肿瘤细胞侵入继发器官后，肿瘤细胞为持续增殖而刺激周边形成新生血管，最终形成转移灶。因此，对内皮细胞中各组分进行深入研究是了解肿瘤发生、发展和转移机制的重要研究方向。ESM1是在1996年由法国科学家首先从人脐静脉内皮细胞cDNA基因库中克隆而来[11]。它是大小约50kDa的可溶性蛋白多糖，其成熟多肽包含165个氨基酸，在第137位丝氨酸残端共价连接单一硫酸皮肤素链[11-12]。随后，ESM1又被证实为硫酸皮肤素蛋白多糖[13]。它主要在人肺内皮细胞和肾内皮细胞中少量表达，后发现在多种内皮细胞中均有表达[11，13-14]，特别是炎症内皮细胞。因此，ESM1被认为在心血管、炎症和内皮功能障碍中发挥着作用。一项包含15项研究的荟萃分析发现，血浆中ESM1表达水平与患者罹患高血压、冠心病等重大心血管疾病的风险密切相关[15]。此外，ESM1亦能与白细胞整合素（LFA-1）结合，阻止LFA-1与其特异性结合位点细胞间黏附分子-1（ICAM-1）相结合，从而影响炎症部位对淋巴细胞的招募[16]。

图6 头颈鳞癌患者ESM1表达检测诊断的ROC曲线

近期研究者们对ESM1在人类肿瘤发生、发展过程中的作用进行研究，结果发现在肾癌、乳腺癌、子宫内膜癌、胃及肠癌等多种人类肿瘤中，ESM1表达水平均明显上调[17]。亦有研究表明，ESM1表达是肺癌等多种恶性肿瘤预后不佳的重要分子标志物之一[18-20]。本文对ESM1在头颈鳞癌中的表达及临床意义作一探讨，以期为头颈鳞癌的临床诊治提供新的方向。本研究通过分析公共数据库中头颈鳞癌全基因组表达数据，获得差异表达基因2 234个，其中ESM1的表达差异最明显。随后在临床收集的样本中也证实了ESM1在头颈鳞癌组织中的表达水平明显高于其对应的癌旁正常组织。同时发现ESM1表达检测诊断头颈鳞癌的AUC为0.96，灵敏度为0.918，特异度为0.939。故笔者认为ESM1表达检测具有简便、灵敏度和特异度均较高的优势，是辅助诊断头颈鳞癌较为理想的指标。利用公共数据库分析发现，不同临床分期的头颈鳞癌患者ESM1表达水平比较差异有统计学意义。随后，根据ESM1表达的中位数将头颈鳞癌患者分成ESM1高、低表达组，绘制生存曲线发现ESM1高表达组头颈鳞癌患者无病生存期明显高于低表达组，而两组患者总生存期比较差异无统计学意义。待明确ESM1与头颈鳞癌预后有关后，进一步分析ESM1促进头颈鳞癌发生、发展的可能机制，结果显示ESM1高表达能激活多种肿瘤相关信号通路，如MAPK信号通路、TGF-β信号通路等。

综上所述，本研究证实头颈鳞癌组织中ESM1表达水平明显升高，ESM1表达可作为头颈鳞癌的潜在分子诊断标志物，且有助于预测头颈鳞癌的预后。