铃兰组织培养中褐变的防治研究

焦晓霖，缪天琳，张秀梅*，王长宝*

(1.佳木斯大学 理学院，黑龙江 佳木斯 154007；2.佳木斯大学 生命科学学院，黑龙江 佳木斯 154007)

铃兰(ConvallariamajalisL.)又称香水草、山谷百合，是百合科的多年生草本植物，通常生于西北、东北和华北地区的林缘灌丛中或针阔混交林林下[1-2]。铃兰可以带花全草入药，它的茎和叶中含有的铃兰毒甙具有强心利尿的功能。从铃兰中还可提取在国际上被列为上等名贵香料的铃兰浸膏，它可以用来调配多种花香型香精，常用在香皂、化妆品等的生产制作之中[3]。因为铃兰种子的收集非常困难，且铃兰的繁殖系数很低，难以满足日益增长的市场需求[4]，所以当前广泛应用于生产的繁育方式主要是通过组织培养获得组织培养苗，然而在组织培养过程中铃兰外植体的褐变普遍发生，这已成为影响铃兰大规模繁殖的主要因素，因此铃兰组织培养能否成功的关键是抑制褐变的产生。本研究基于前人有关褐变的报道上通过暗培养处理以及在培养基中添加吸附剂聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和活性炭(AC)、抗氧化剂硫代硫酸钠(Na2S2O3)和抗坏血酸(VC)等4种抑褐剂的方法，获得抑制铃兰褐变的最佳方法。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 外植体的选取。选择健壮生长的铃兰植株，将其根茎作为外植体材料。

1.1.2 培养基。基本培养基为MS+ 6-BA 0.3 mg/L + NAA 0.1 mg/L[5]，MS培养基中附加9.0 g /L的琼脂粉和30.0 g/L的蔗糖，pH为6.0。

1.2 处理方式

将铃兰的根茎段先用表面活性剂清洗，除去表面的尘土和杂质等，再用水流冲洗30 min，将其置于超净工作台上用75%的乙醇消毒30 s，用无菌水冲洗3～4次，即刻浸入浓度为0.1%的HgCl2溶液中消毒8 min，用无菌水冲洗3～4次，用已灭菌的滤纸将其吸干，最后将铃兰根茎切成长约0.3 cm 的长度、并具有1个节间的根茎段[6]，将其分别接种于对应的培养基上。培养温度为25 ℃，光照时间为12 h/d，光照强度为2000～2500 lx。每种处理方式接种5瓶，每瓶接种4个外植体，进行3次重复试验，30 d后统计褐变率。

1.2.1 抗褐变剂对铃兰根茎组培的褐变影响实验。将外植体分别接种在添加以下浓度抗褐变剂的培养基中，将不含抗褐变剂的一组作为对照实验(CK)，最后计算褐变率并比较。

表1 不同类型和浓度的抗褐变剂

1.2.2 暗培养对铃兰根茎组培的褐变影响实验。将外植体接种于基本培养基上，在以下4个条件下培养：(1) 接种后，在25 ℃的条件下进行黑暗处理5 d，然后转移至光培养，光照时间为12 h/d;(2)接种后,在25℃下进行黑暗处理10 d,后转移至光培养,光照时间为12 h/d;(3) 接种后,在25 ℃下进行黑暗处理15 d,后转移至光培养,光照时间为12 h/d;(4)接种后,在25 ℃下直接进行光培养,光照时间为12 h/d,并以此组作为对照组(CK)。最后，计算褐变率以及记录诱导出的芽的生长情况并进行比较。

1.3 数据统计

用Excel和 SPSS 20.0 统计软件对原始数据进行处理。

2 结果与分析

2.1 抗褐变剂对铃兰根茎组培褐变的影响

在培养基中加入不同浓度的抗吸附剂和抗氧化剂可以明显降低铃兰外植体的褐变程度，褐变率均低于CK，且PVP的最佳浓度为2.0 g/L，褐变率为33.33%；VC的最佳浓度为2.0 g/L，褐变率为25.33%；Na2S2O3的最佳浓度为0.5 g/L，褐变率为50.00%；AC的最佳浓度为0.5 g/L，褐变率为30.00%。其中，2.0 g/L的VC抗褐变剂效果最好，比CK低41.34%，实验结果如图1所示。

图1 不同种类抑褐剂浓度对褐变的影响

2.2 暗培养对铃兰根茎组培的褐变影响

在许多的植物组织培养中适当的暗处理可推迟或减轻褐变的发生，经暗处理后外植体的褐变率均低于CK，随着暗处理的时间的增加，褐变率逐渐降低，但暗处理10 d的效果最好，褐变率比CK降低41.67%,且诱导出来的芽色泽鲜嫩长势良好。尽管经15 d的暗处理褐变率最低，但因为暗处理时间过长导致诱导长出的芽生长和发育情况并不理想。实验结果如表2所示。

表2 暗培养对褐变的影响

3 结果与讨论

近些年来，前人针对植物组织培养中普遍发生的褐变问题做了大量的研究[7-9]，认为褐变是指接种外植体后，在组培过程中，因切割造成细胞的损伤，使伤口处分泌出酚类化合物，在有氧的条件下，酚类化合物在多酚氧化酶(PPO)的催化作用下氧化为醌，醌再通过非酶促反应产生有色物质使组织发生褐变，呈棕褐色或深褐色，并逐步扩散到培养基中，抑制细胞内其它酶的活性，从而影响细胞的正常代谢，毒害整个组织，甚至导致愈伤组织的凋亡。外植体的褐变程度与培养条件、吸附剂的添加物等因素具有很大的相关性。适宜的培养条件、添加适合的吸附剂等因素可以有效地削减褐变对植物组织培养的影响。

抗褐变剂抑制外植体的褐变主要是通过降低底物(如酚类物质)、相关酶活性以及改变相关基因的表达方式来实现。不同的抗褐变剂的对外植体的抗褐变效果是不同的，本实验对抗褐变剂的研究表明，PVP、VC、AC和Na2S2O3这4种抗褐变剂均具有减少褐变的作用，这是因为吸附剂PVP和AC具有较强的吸附能力，可以吸附外植体伤口处分泌的酚类物质及其被氧化而生成的醌，从而防止外植体褐变的产生；抗氧化剂VC可改变外植体周围的氧化还原电位，将酚氧化酶的Cu2+还原成Cu+，从而抑制酚类的氧化，减少褐变；抗氧化剂Na2S2O3则可影响酚类化合物与酶的结合，致使褐变减少[10-12]。本实验结果与陈瑶瑶等[13]、段文武等[14]的研究报告中这几种抗褐变剂对外植体有抑褐作用的结果一致，在培养基中添加防止酚类氧化的抗氧化剂和吸收醌类物质的吸附剂可减少褐变的产生。

对外植体进行暗培养的研究结果表明，适当的暗培养可降低铃兰外植体的褐变率。如果时间过短，抑制褐变的效果不明显，原因可能是前期采用暗培养可以抑制酚类化合物的合成，降低多酚氧化酶的活性，减少酚类的氧化，从而减轻褐变，然而如果暗培养处理的时间过长，诱导产生的根茎芽的存活率会降低。在王倩颖等[15]的研究中显示，培养初期的黑暗环境培养可以降低外植体的褐变程度，随着暗培养时间的延长，其叶片和茎段的褐变程度逐渐增加，但根部褐变程度却逐渐降低，这是因为植物的根部对光不敏感，因此随着暗培养的时间的增长，根茎段的褐变率降低，这与本实验中采用铃兰根茎为外植体的结果一致。但夏小环等[16]的试验结果显示，在暗培养的条件下，外植体会发生严重褐变，这可能与实验采用的外植体的材料以及材料的部位有关。

综上所述，在单因素影响下，对外植体进行适当暗培养处理，在培养基中添加抗褐变剂均可降低褐变率，且暗培养10 d的效果最佳，抗褐变剂对外植体褐变的影响为VC(2.0 g/L)>AC(0.5 g/L )>PVP(2.0 g/L)> Na2S2O3(0.5 g/L)。