奶牛乳房炎主要病原菌的分离鉴定及耐药性研究

吴利军 李佳琳 陈夏冰 万平民 邵志勇 何斌 杨文海 陈洁 金尔光 潘中宝 童伟文 周源 刘武

摘要：为了解奶牛乳房炎病原菌的菌群分布及耐药性情况，对湖北省一奶牛场开展为期1年的病原菌分离鉴定和耐药性研究。结果表明，从165份乳样中共分离鉴定出9个科16个属的235株病原菌。其中葡萄球菌83株，占35.0%;中型无绿藻36株，占13.5%;鲁氏不动杆菌28株，占11.9%;大肠杆菌12株，占5.1%;停乳链球菌7株，占2.9%;其他病原菌占31.6%。耐药试验结果显示，20株分离菌对测试的14种抗菌药物均产生不同程度耐药性，最少对1种药物产生耐药性，最多达到14种。敏感性最高的抗菌药物为氟苯尼考，敏感率达到75%。研究结果可为奶牛乳房炎的防控和临床用药提供基础性数据。

关键词：奶牛乳房炎;病原菌;分离鉴定;耐药性

中图分类号：S857.2+6         文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2019）21-0145-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.21.031

Abstract： In order to understand the microflora distribution and drug resistance of the pathogenic bacteria of cow mastitis， a one-year pathogen isolation and identification and drug resistance study was conducted in a dairy farm in Hubei Province. The results showed that 235 strains of pathogens belonging to16 genera of 9 families were isolated from 165 milk samples. Among them， 83 strains were Staphylococcus， accounting for 35%; 36 strains were Protothecazopfii， accounting for 13.5%; 28 strains were Acinetobacterrubrum， accounting for 11.9%; 12 strains were Escherichia coli， accounting for 5.1%; 7 strains were Streptococcusdysgalactiae， accounting for 2.9%; and other strains accounting for 31.6%. The results of drug resistance test showed that 20 isolates had different degrees of drug resistance to the 14 antibiotics tested. The pathogen is resistant to at least one drug， and the highest is resistant to 14 drugs. The most sensitive antibiotic is florfenicol， with a sensitive rate of 75%. The results provide a fundamental data for the prevention and control the dairy cow mastitis and clinical medication.

Key words： cow mastitis; pathogenic bacteria; isolation and identification; drug resistance

奶牛乳房炎是奶牛養殖业中的一种常见病和多发病，会导致奶牛泌乳量下降，影响乳制品质量，进而危害食品卫生和安全，是影响奶牛业发展的主要疾病之一[1]。全世界约有2.2亿头奶牛，其中近1/3的奶牛患有各种类型的乳房炎，每年因乳房炎造成的经济损失超过350亿美元[2]，中国每年因奶牛乳房炎造成的经济损失约1.35亿元[3]。奶牛乳房炎根据临床症状分为隐性乳房炎和临床型乳房炎[4]。隐性乳房炎患病奶牛没有明显的临床症状，观察不到炎症反应，乳汁外观无明显变化，但乳制品却发生实质性的改变。临床型乳房炎患病奶牛的乳腺一般有红肿、局部发热，接触有痛感以及乳汁黏稠，结块或呈水样等异常变化。临床上大多数奶牛乳房炎处于隐性状态，占发病总数的75%～95%，对奶牛业造成的危害更大且更加普遍。引起奶牛乳房炎的因素较多，其中病原微生物感染是主要病因。已发现150多种病原微生物能够引起奶牛乳房炎，其中以葡萄球菌、链球菌和大肠杆菌为主[5]。奶牛乳房炎的防治以抗菌药物治疗为主，随着抗生素的长期使用，细菌对抗菌药物的耐受性也随之增强，给奶牛乳房炎的防治带来新的挑战[6]。为了使奶牛乳房炎的防治措施更加有效，必须对奶牛乳房炎病原菌的流行和耐药性有全面的认识和了解。本研究对湖北一牛场展开为期1年的奶牛乳房炎病原菌的分离、鉴定工作，并对主要病原菌进行耐药性研究，以期为制订科学、合理的奶牛乳房炎治疗方案提供依据。

1  材料与方法

1.1  主要试剂

胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA）、胰蛋白胨大豆肉汤培养基（TSB）、药敏纸片均购自杭州微生物试剂有限公司;DL2000 DNA Maker、Premix Taq购自Takara公司;革兰氏染色试剂购自青岛海博生物技术有限公司。

1.2  样品采集

根据牛乳体细胞数（Somatic cell count，SCC），每个月定期采集SCC≤50万/mL、50万/mL500万/mL的奶样。采样前先用温水清洗乳头及乳房，擦干，消毒，弃掉头三把奶，用灭菌的50 mL离心管收集奶样50 mL，做好标记，立刻置于冰盒内，送至实验室进行病原菌分离。

1.3  病原菌的分离培养

取1 mL奶样在无菌条件下接种于TSA培养基上，37 ℃静置培养18 h。挑取典型菌落进行革兰氏染色、镜检，初步鉴定病原菌特征，然后进行纯化培养。

1.4  药敏试验

利用K-B涂布法测定分离菌株对14种常见抗菌药物的敏感性，药敏结果判定依据美国临床和实验室标准协会标准（NCCLS）。

1.5  16S rRNA序列鉴定

设计合成一对细菌16SrRNA基因通用型检测引物（F：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3;R：5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3）。采用菌液PCR对分离菌进行PCR扩增。PCR扩增体系，DNA模板1.0 μL菌液，Premix Taq 10.0 μL，上下游引物各0.5 μL，补ddH2O至25.0 μL。PCR扩增程序，95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，30个循环;72 ℃ 10 min。PCR扩增产物经回收、纯化后外送测序，将测序结果通过NCBI数据库进行BLAST序列分析。

2  结果与分析

2.1  奶牛样品体细胞测定

每月全群采集奶样，采用流式细胞计数法对SCC进行测定，根据SCC统计结果，抽样进行病原菌的分离与鉴定，奶样采集情况见表1。

2.2  病原菌的分离与鉴定

对分离菌株进行16S rRNA通用型引物扩增，部分扩增结果见图1，在大小约1 500 bp处具有特异性扩增条带。通过序列比对分析，从165份奶样中分离鉴定出9科16属235株病原菌。常见的主要致病菌包括葡萄球菌属的金黄色葡萄球菌、溶血性葡萄球菌、腐生葡萄球菌、松鼠葡萄球菌、木糖葡萄球菌，共分离鉴定出83株，占35.0%;分离鉴定出链球菌属的停乳链球菌7株，占2.9%;分离鉴定出埃希氏菌属的大肠杆菌12株，占5.1%;检出率比较高的其他病原菌还包括无绿藻属中型无绿藻，共分离鉴定出36株，占13.5%;分离鉴定出不动杆菌属鲁氏不动杆菌28株，占11.9%;检出菌中还包括绿色气球菌、粪肠球菌、肺炎克雷伯氏菌、奇异变形杆菌、费氏柠檬酸菌等。鉴定结果见表2。选取常见致病菌进行革兰氏染色，金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌，排列成葡萄串状;停乳链球菌呈现革兰氏阳性球菌，并呈现链状排列;大肠杆菌呈现革兰氏阴性直杆菌，两端钝圆，具体见图2。

2.3  药敏试验结果

選用牛场常用的林可胺类、酰氨醇类、氨基糖苷类、β-内酰胺类、四环素类、喹诺酮类、大环内酯类、和磺胺类等共14种抗菌药物进行药敏试验，结果见表3。不同的病原菌对药物的敏感性表现出差异。其中氟苯尼考、卡那霉素、庆大霉素、头孢噻肟、环丙沙星、复方新诺明对20种分离菌的敏感率达到65%以上，敏感率最高的为氟苯尼考，达到75%。对分离菌进行多重耐药性分析表明，20株分离菌对所测试的14种抗菌药物均产生不同程度的耐药性。其中耐药性最弱的病原菌为绿色气球菌、假单胞杆菌、棒状杆菌和微小杆菌，仅对一种抗菌药物产生耐药性;耐药性最强的病原菌为奇异变形杆菌和中型无绿藻，对所测试的14种抗生素均产生耐药性。

3  小结与讨论

已发现的诱发奶牛乳房炎的病原微生物有150多种，包括细菌、真菌、酵母菌、藻类和病毒，其中细菌是导致奶牛乳房炎的主要病原微生物[5]。本研究对湖北一牛场连续13个月每月定期采集的奶样进行病原菌分离、鉴定，观察病原菌的流行和变化情况，共采集奶样165份，分离到9科16属235株病原菌，进一步分析发现，引起牛场奶牛乳房炎的病原菌主要分为3类。一类是传染性微生物，主要包括金黄色葡萄球菌43株，占分离菌总数的18.3%;一类是环境微生物，主要包括大肠杆菌12株，停乳链球菌7株，粪肠球菌6株，肺炎克雷伯氏菌2株，奇异变形杆菌6株，费氏柠檬酸菌8株，占分离菌总数的17.4%;一类是其他微生物，主要包括奈瑟氏菌科、芽孢杆菌科、球盖菇科、放线菌科和绿藻科的病原菌，其中绿藻科的中型无绿藻共分离鉴定出36株，占比15.3%。无绿藻属于绿球藻，是自然界一种常见的条件致病真菌，1952年被确定为奶牛乳房炎的致病菌，感染后能够引起奶牛产奶量急剧下降，乳房肿胀，乳汁呈水样，伴有絮状沉淀，并且容易成为感染源[7]。由中型无绿藻引起的乳房炎在欧美国家被广泛报告，但是国内鲜有相关的案例[8]。研究者报道了北京某牛场由中型无绿藻引起的临床型乳房炎[9]，从江苏部分养殖场患乳房炎病的奶样中分离出4株左氏无绿藻[10]。本研究从患病奶牛奶样中分离鉴定的病原微生物结果表明，该牛场奶牛乳房炎致病菌可能由多种细菌混合感染引起。建议牛场一方面在日常管理方面保持牛舍内外环境卫生，勤打扫、勤换垫料，规范挤奶操作流程，避免在挤奶过程中存在交叉污染[11];另一方面，建立乳房炎早期诊断方法，早发现早治疗，从而减少传染源[12，13]。

药敏试验结果表明，引起奶牛乳房炎的病原菌对临床上常用的抗菌药物产生了不同程度的耐药性。金黄色葡萄球菌、停乳链球菌和大肠杆菌是引起该牛场奶牛乳房炎的优势菌，其中金黄色葡萄球菌对青霉素和诺氟沙星产生耐药，停乳链球菌对所测试的13种抗菌药物产生耐药，大肠杆菌对林可霉素、青霉素、四环素和复方新诺明产生耐药，另外分离到一株中型无绿藻，对所测试的14种抗菌药物均产生耐药性，这与前人的研究结果基本一致[9]。由于抗菌药物的滥用，致使细菌的耐药性增强，不仅给治疗奶牛乳房炎带来了障碍，而且严重威胁人类健康。在治疗奶牛乳房炎的过程中要贯彻“预防为主，防治结合”的方针，除了加强日常饲养管理，还要定期对奶样中的病原微生物进行耐药监测，为饲养管理提供切实可行的用药方案，切实保障养殖业生产安全、动物性食品安全和公共卫生安全。

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