香烟提取物对人支气管上皮细胞抗衰老因子Klotho的影响分析及应对措施的效果研究

杨林，贾钦尧，宋珊

慢性阻塞性肺疾病（简称“慢阻肺”）是一种慢性炎性疾病，临床以持续、进行性发展的气流受限为主要特征，研究表明其发生与人体过多吸入香烟烟雾或颗粒等有害刺激物引发的气道炎症有关［1-2］。气道上皮是肺与外界接触的第一道屏障，人支气管上皮细胞（Human bronchial epithelial cells，HBE）分布于气管腔内表面，在抵御病原体、有害气体、过敏原等外来刺激过程中发挥重要作用，对于维持正常的气道功能具有重要作用，其异常调控会影响肺组织对外来刺激物的防御能力［3-5］。在病理条件下，受到致病因素的反复刺激，HBE细胞会释放多种炎性介质和趋化因子，使机体局部免疫反应增强，进而活化多种炎症细胞［6-8］。有研究表明抗衰老因子Klotho在HBE细胞中有着较高的表达量，且其在健康人群中的表达水平高于吸烟人群，在慢阻肺病人中的表达水平偏低［9］。同时外源性重组Klotho蛋白能够下调白细胞介素（Interleukin，IL）-6、单核细胞趋化蛋白1（Monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）mRNA 的 表 达 水平［10］。相关研究认为吸烟可增加慢阻肺的发生风险［11］，因此本研究拟以HBE细胞为研究对象，探讨香烟提取物对HBE细胞抗衰老因子Klotho的影响及相关治疗措施的效果。

1 资料与方法

1.1 一般资料 以2016年3月至2017年8月在仪陇县人民医院进行体检的健康人员30例作为对照组，其中男20例，女性10例，年龄（61.32±6.78）岁，范围为45～73岁。选择同期在该院经肺功能检查确诊的慢阻肺病人30例，除合并高血压、糖尿病、冠心病、自身免疫系统疾病、癌症、哮喘、结核病等严重疾病，且近2周内未使用茶碱或糖皮质激素，其中男性21例，女性9例，年龄（60.54±6.44）岁，范围为45～72岁。两组人群性别比例（χ2＝1.021，P＝0.102）、年龄（t＝0.812，P＝0.412），差异无统计学意义。HBE细胞购于北京肿瘤研究所。本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求，病人或近亲属对研究方案签署知情同意书。

1.2 香烟提取物制备取两根剪去过滤嘴的香烟，在改良的注射器驱动装置一端点燃，使香烟燃烧产生的烟雾以50 mL/min的速度通过该装置，并使其溶在10 mL 1640培养基中。之后调节溶液PH值为7.4，再以0.22 μm微孔滤器过滤。香烟提取物需现用现制，并保证每次在制备后的30 min内开始使用。上述方法制备的香烟提取物为100%，使用时以1640培养基稀释至合适浓度。

1.3 细胞培养及处理HBE细胞使用含10%胎牛血清的高糖DMEM完全培养基培养，在37℃、5%二氧化碳、饱和湿度条件下常规培养，每2～3天进行1次传代，在细胞对数期进行实验。

取对数生长期HBE细胞，以2×105/mL的密度接种于6孔板，分为对照组（A组），模型组（B组），阳性对照组（C组），地塞米松低剂量组（D组）、地塞米松中剂量组（E组）、地塞米松高剂量组（F组）（其中D、E、F组为实验组），每组设3个复孔，共3块6孔板。阳性对照组和实验组在常规培养24 h后加入1%香烟提取物处理24 h，之后阳性对照组给予外源性200×10-12mol/L Klotho蛋白处理，实验组分别在共培养1 h后分别给予1×106mol/L，1.5×106mol/L和2×106mol/L的地塞米松。

1.4 观察指标及方法 （1）健康与慢阻肺人群外周血细胞因子mRNA表达检测，采用酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测两组外周血细胞因子IL-8、IL-6、肿瘤坏死因子（TNF）-α、Klotho表达水平。（2）ELISA检测不同刺激条件下HBE细胞释放炎性因子水平，收集药物处理24 h及对照组细胞培养上清液，-20℃保存，测定时从冰箱取出试剂盒，在室温下平衡，各孔分别加入50 μL样品或标准品，轻轻混匀1 min，以密封膜密封，25℃孵育2 h；之后倒掉板内液体，每个孔中加入250 μL洗涤液洗涤，再次倒掉液体，反复洗涤5次，最后拍干。之后依次进行加50 L生物素标记抗体于样品或标准品孔内，洗板，加100 L辣根过氧化物酶标记的抗生物素链菌素（Streptavidin-HRP）酶联二抗溶液于各孔，用密封膜封住板孔，37 ℃孵育45 min；洗板，加100 L 3，3’，5，5′-四甲基联苯胺（TMB）底物溶液，室温避光反应孵育30 min；每孔分别加入100 μL终止反应液；使用酶标仪在450 nm波长处测定。（3）逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测不同刺激条件下HBE细胞释放炎性因子mRNA水平，收集药物刺激3 h及对照组细胞样品，每个样品加入1 mL Trizol试剂，吹打收集细胞样品于1.5 mL无RNA酶离心管，指弹，室温静置15 min，存放于-20℃保存备用。测定时，采用RNA提取试剂盒提取RNA，并反转录得到cDNA，最后采用RT-qPCR进行测定。引物由Invitrogen公司合成，引物序列如下，Human IL-8：sense，5′-CTCTTGGCAGCCTTCCTGATT-3′Antisense，5′-TATGCACTGACATCTAAGTTCTTTAGCA-3’；Human IL-6：sense，5′-AGCCCTGAGAAAGGAGACATGTA-3′Antisense，5′-CATCTTTGGAAGGTTCAGGTTGT-3′。

1.5 统计学方法采用SPSS 22.0软件进行数据处理，计量资料满足方差齐性和正态分布，采用xˉ±s表示，两组间比较采用两独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，在方差分析有意义的基础上，再采用LSD-t检验进行多组间的两两比较；计数资料采用χ2检验。均以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 健康与慢阻肺人群外周血细胞因子检测慢阻肺病人外展血IL-8，IL-6及TNF-α含量均显著高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；慢阻肺病人外周血Klotho蛋白含量显著低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 健康与慢阻肺人群外周血细胞因子检测/（pg/mL，xˉ±s）

2.2 ELISA检测各组HBE细胞炎性因子表达水平 如下表2所示，单因素方差分析结果显示，各组间IL-8、IL-6和TNF-α均差异有统计学意义（P＜0.05），经LSD-t检验组间两两比较结果显示，B组细胞上清液中IL-8、IL-6、TNF-α表达水平显著高于A组，差异有统计学意义（P＜0.05）。B组细胞上清液中IL-8、IL-6、TNF-α表达水平高于D、E、F组，均差异有统计学意义（P＜0.05）。D、E、F组细胞上清液中IL-8、IL-6、TNF-α含量依次降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表2 ELISA检测各组HBE细胞培养上清液中炎性因子含量/（pg/mL，xˉ±s）

2.3 RT-PCR检测各组HBE细胞炎性因子表达水平如下表3所示，单因素方差分析结果显示，各组间IL-8 mRNA、IL-6 mRNA、TNF-α mRNA表达水平均差异有统计学意义（P＜0.05），经LSD-t检验组间两两比较结果显示，B组细胞IL-8 mRNA、IL-6 mRNA、TNF-α mRNA表达水平显著高于A组，差异有统计学意义（P＜0.05）。B组细胞IL-8 mRNA、IL-6 mRNA、TNF-α mRNA表达水平高于D、E、F组，均差异有统计学意义（P＜0.05）。D、E、F组细胞IL-8 mRNA、IL-6 mRNA、TNF-α mRNA表达水平依次降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表3 RT-PCR检测各组HBE细胞炎性因子mRNA表达水平/xˉ± s

3 讨论

烟草烟雾中含有大量的自由基和其他多种有毒物质，对人体可造成多种危害，如细胞癌变、气道损伤以及肺功能障碍等［12-13］。其中，长期吸烟病人慢阻肺的发病率明显偏高，其主要发病机制为慢性气道炎症、上皮细胞氧化应激损伤。研究表明，中性粒细胞激活在吸烟引起的肺功能损伤过程中发挥关键性作用，其中IL-8、IL-6和TNF-α等炎性因子在中性粒细胞趋化过程中发挥重要作用［14-15］。在此背景下，本研究首先对健康人群及慢阻肺人群肺功能和外周血细胞炎性因子表达水平进行分析，进而通过以HBE细胞构建模型，探讨抗炎药地塞米松对香烟提取物诱导的HBE细胞炎性因子升高的影响，为临床选择合理的治疗方式提供依据。

本研究结果表明慢阻肺病人外展血IL-8，IL-6及TNF-α水平均显著高于对照组；慢阻肺病人外周血Klotho蛋白表达水平显著低于对照组。上述结果说明慢阻肺病人外周血炎性因子含量显著升高，这与相关研究［14-15］报道基本相符。此外，慢阻肺Klotho蛋白含量表达显著降低，Klotho作为一种Ⅰ型跨膜蛋白，在肾脏、大脑组织分别较多，具有重要的生物功能。有研究表明Klotho基因发生突变的小鼠可表现出类似肺气肿的多种症状，如出现肺泡壁断裂、肺泡腔变大、呼吸时间变长等。因此，Klotho蛋白功能异常可能与肺气肿形成，进而影响慢阻肺病情进展。

此外，体外实验表明，B组细胞培养上清液IL-8、IL-6、TNF-α含量显著高于A组，这一结果表明以香烟提取物作为体外刺激HBE细胞构建支气管慢性炎症的模型是成功的。B组细胞IL-8、IL-6、TNF-α含量高于D、E、F组。D、E、F组细胞IL-8、IL-6、TNF-α含量依次降低，差异有统计学意义。根据RT-qPCR结果，B组细胞IL-8、IL-6、TNF-α mRNA表达水平显著高于A组。B组细胞IL-8、IL-6、TNF-α mRNA表达水平高于D、E、F组。D、E、F组细胞IL-8、IL-6、TNF-α mRNA表达水平依次降低。上述结果说明，地塞米松能够下调香烟提取物引起的HBE细胞炎性因子分泌增加。其原因可能是地塞米松能够减轻和避免组织对炎症的过度反应，从而有助于减轻临床多种炎症表现。此外，作为一种激素类药物，其能抑制包括巨噬细胞和白细胞等炎症细胞在炎症部位聚集，同时抑制吞噬作用、溶酶体酶的释放，对多种炎症化学中介物的合成和释放均可产生影响［16-17］。从而有助于炎性因子水平的降低，缓解炎性症状。

综合上述分析，可得出结论，香烟提取物体外刺激HBE细胞，可显著降低Klotho因子含量，同时上调多种炎性因子基因的表达，体外给予地塞米松干预能够降低HBE细胞炎症反应。