栝楼不同药用部位质量控制的研究进展

2019-12-09 23:20:04穆向荣林林焦阳林永强
药学研究 2019年7期
关键词:瓜蒌皮栝楼天花粉

穆向荣,林林,焦阳,林永强

(山东省食品药品检验研究院,山东济南250101)

瓜蒌子、瓜蒌皮、瓜蒌、天花粉分别来源于葫芦科植物栝楼(TrichosantheskirilowiiMaxim.)或双边栝楼(Trichosanthes rosthorniiHarms)的干燥成熟种子、果皮、果实和根。瓜蒌子具有润肺化痰,滑肠通便的功效;瓜蒌皮具有清热化痰,利气宽胸的功效;瓜蒌具有清热涤痰,宽胸散结,润燥滑肠的功效;天花粉具有清热泻火,生津止渴,消肿排脓的功效。在二母宁嗽丸、止咳橘红丸、乙肝益气解郁颗粒和降甲糖片等中成药中用量很大。这4味药材的质量标准均收载于《中国药典》2015年版,质量标准的控制项目少,不能有效地控制药材的安全性和有效性,制约了该类饮片和相关制剂的质量控制和临床应用。当前,有文献对其外源性污染物进行报道,瓜蒌子、瓜蒌皮、瓜蒌、天花粉有效组分的种类、化学成分、药理作用的文献也常见,但都片面地反映了药材的安全有效。本文首次围绕栝楼不同药用部位的内源性、外源性污染物含量测定,有效组分的化学成分、提取及分离纯化方法、含量测定等研究展开综述,为瓜蒌子、瓜蒌皮、瓜蒌和天花粉质量标准的完善奠定理论基础。

1 瓜蒌子、瓜蒌皮、瓜蒌和天花粉安全性的研究

中药安全分内源性和外源性两方面,包括中药自身有毒有害成分、重金属污染、微生物污染、农药残留污染、二氧化硫、有机污染物以及中药掺假等。瓜蒌和天花粉的安全性研究报道较多。据报道,天花粉中的葫芦素B虽然具有明确的抗肝炎、抗肿瘤活性[1],但也有较大毒性,且其毒性反应与剂量密切相关[2]。孙文等[3]运用HPLC-UV法测定栝楼的雄根、雌根、茎、叶、雄花、幼果、未成熟果实、成熟果实、未成熟果皮、成熟果皮、未成熟果瓤、成熟果瓤、种子、果柄等部位的葫芦素B含量,结果发现不同部位中的含量均不等,数据出入很大。这提示我们为合理控制药材安全性,栝楼不同药用部位的葫芦素B限量应分别制定。

马双成等[4]针对中药中外源性有害物质残留问题,对样品普查进行归纳总结,认为目前影响中药安全性的最重要的外源性污染物为个别药材中的真菌毒素残留,因我国水系和土壤的污染,也应高度关注中药中重金属残留问题;还应将高毒、禁限用农药及高检出率农药的农药残留量作为重点监控对象。瓜蒌具有较高的糖分,极易遭受虫蛀和发霉,而且切丝加工后,若久置则种子的断面氧化,导致颜色变黄,并产生黄曲霉毒素。但目前尚无文献报道瓜蒌子、瓜蒌皮、瓜蒌和天花粉的真菌毒素污染情况。瓜蒌皮和天花粉中的重金属残留问题已有报道,主要为采用石墨炉原子吸收分光光度法进行测定,测定结果远低于规定要求[5]。巢志茂[6]报道在瓜蒌栽培生产和加工贮存环节中,虫害防治会用到磷铵、甲基异柳磷和氧化乐果等高毒农药。林林等[7]建立了气相色谱-质谱测定瓜蒌中70种农药残留方法和QuEChERS-SPEUHPLC-MS/MS测定瓜蒌中156种农药残留方法[8],并测定了来自全国11个省份的84批瓜蒌样品的农药残留量,同时结合瓜蒌种植基地的产地调研结果,对瓜蒌的农药残留情况进行分析和总结:瓜蒌的农药残留情况比较普遍,虽然大部分检出值较低,但滴滴涕、对硫磷、三氯杀螨醇和特丁硫磷这5种禁限用农药均存在含量超限问题[9]。王莹[10]采用GCMS对天花粉中198个农药指标进行了测定,结果只检测出天花粉中含有PP'DDE,含量为0.014mg·kg-1。迄今,尚无瓜蒌子、瓜蒌皮和瓜蒌贮存中是否熏硫的研究报道,二氧化硫残留量的检测仅见于天花粉中,《中国药典》2010年版第2增补本正式在天花粉药材及其饮片品种项下增加二氧化硫残留量检查项目。此外,吴翠等[11]报道瓜蒌药材有未成熟果实流入市场掺假的现象,由于未成熟果实干燥后外观皱缩严重,当地不法商人将未成熟的种子和果瓤,混入胶和红糖,裹以外地购买的瓜蒌皮,制成大小相当的瓜蒌,压片切丝,造成市场销售和流通的瓜蒌饮片质量严重下降。

由上可知,栝楼不同药用部位自身的有毒有害成分及其他外源性污染物的研究较少,瓜蒌子、瓜蒌皮、瓜蒌和天花粉的安全性研究多见于农药残留的检测,而且评价药材安全性的指标未能与药材从源头到临床的各个环节紧密联系,无法有效确保药材的安全性,现状不容乐观。

2 瓜蒌子、瓜蒌皮、瓜蒌和天花粉有效组分的研究

瓜蒌子、瓜蒌皮、瓜蒌和天花粉的有效组分如多糖类、蛋白质和氨基酸类、黄酮及其苷类、皂苷类等均有文献报道。但由于药用部位不同,其所含的有效组分也不同。本文通过综述各有效组分的化学成分、提取及分离纯化方法和含量测定的研究以推动药材及饮片更高水平的质量标准的制定工作。

2.1 多糖类 中药多糖具有促进免疫调节、抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、抗炎、抗应激、抗辐射及抗衰老等多种生物活性,且因其毒副作用小、无残留、不产生耐药性等优点而成为研究热点。熊利芝等[12]通过实验研究得出栝楼籽多糖对·OH自由基的清除能力强于柠檬酸和抗坏血酸,但其对·自由基的清除能力弱于抗坏血酸和柠檬酸。瓜蒌皮多糖的抗氧化活性研究结果表明其对·OH自由基和NO-均

2具有较强的消除作用,因此,瓜蒌皮多糖是一种天然的抗氧化剂[13]。多篇文献报道天花粉多糖具有降血糖、抗肿瘤、增强免疫的作用[14~16]。鉴于瓜蒌多糖和天花粉多糖的多重生物活性,很多学者对该有效部位的提取及分离纯化方法进行了研究。

多糖的提取工艺中常见的传统的提取方法有水提醇沉法、碱提取法、酸提取法和索氏提取法。新型的提取技术有超声波提取法、微波提取法、酶法、超临界流体萃取技术和半仿生提取法。屠婕红等[17]利用水提醇沉法提取瓜蒌皮中水溶性多糖,黄晓兰等[18]比较了加热回流、不同温度浸提、超声波振荡提取天花粉多糖效果,最终确定采用 45℃超声波振荡的提取方法。微波提取法、超临界CO2萃取法、纤维素酶法等新型提取工艺也应用于瓜蒌子、瓜蒌皮、瓜蒌和天花粉多糖的提取。综合文献研究可得,微波提取法提取瓜蒌皮多糖得率最高,可达2.52%,比传统提取法得率高2.7倍,纤维素酶法提取天花粉多糖得率最高,可达5.48%。

中药多糖的纯化方法有分步沉淀法、盐析法、透析法、超滤法和柱层析法[16]。由于瓜蒌子、瓜蒌皮、瓜蒌和天花粉化学成分复杂,纯化多糖时往往先进行脱色、脱脂、脱蛋白等处理,再采用一种或几种纯化方法进行净化。

中药中多糖测定方法有比色法、滴定法、高效液相色谱法、气相色谱法、薄层扫描法和高效毛细管电泳法等,以前3种方法最为常用。目前,测定瓜蒌子、瓜蒌皮、瓜蒌和天花粉的多糖含量时,均用葡萄糖为对照品,采用苯酚-硫酸法或者蒽酮-硫酸法进行测定。但这种比色法因忽视了各药材中多糖组成成分的复杂性而导致检测结果偏离实际值。为此,很多学者对天花粉多糖、瓜蒌皮多糖的单糖组成进行分析,以确保检测结果的准确性。黄晓兰等[19]采用GC-MS、HPLC分析得出天花粉多糖是由鼠李糖、阿拉伯糖、果糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖组成的杂多糖,这与屠婕红等[20]通过薄层色谱法和气相色谱法分析得出的天花粉多糖是一种由葡萄糖组成的均多糖的结论不一致。郝变等[21]采用高效液相色谱结合PMP衍生化法分析得出瓜蒌皮多糖由D-甘露糖、D-鼠李糖、半乳糖醛酸、D-葡萄糖、D-半乳糖、D-木糖、阿拉伯糖7种单糖组成。由此可见,不同分析方法对瓜蒌皮和天花粉多糖的单糖组成分析结果不同,这无疑会影响其含量测定结果。因此亟须进一步研究栝楼各药用部位所含多糖的单糖组成,对以该有效部位评价瓜蒌子、瓜蒌皮、瓜蒌和天花粉的质量提供技术支撑。

2.2 蛋白质和氨基酸类 瓜蒌皮和天花粉中的蛋白质和氨基酸类研究报道较多,主要体现在γ-氨基丁酸、瓜氨酸的含量测定方面。瓜蒌皮的总氨基酸有良好的祛痰作用,瓜蒌皮氨基酸类成分中精氨酸含量相对较高,研究表明精氨酸具有抗高血压、抗脂质过氧化等作用[22]。氨基酸类有效部位的提取方法为超声提取法,提取溶剂有50%甲醇、50%乙醇以及盐酸溶液等。常用的含量测定方法为双波长薄层扫描法和柱前衍生高效液相色谱法。杨玉琴等[23]采用双波长薄层色谱扫描法测得15个不同产地天花粉中瓜氨酸的含量,对展开剂优化后使各个斑点分开,以保证结果相对准确。而岳瑞等[24]则认为薄层扫描时2%茚三酮试液会引起显色后测定误差,故建议用1%的茚三酮试液进行显色。郝变等[25]对异硫氰酸苯酯(PITC)和邻苯二甲醛(OPA)两种柱前衍生方法测定精氨酸的含量进行比较,结果发现OPA衍生法操作简便,结果准确,可以用于瓜蒌皮中精氨酸的含量测定。为避免衍生物不稳定等问题,李爱峰等[26]以高效液相色谱-蒸发光光散射法测定瓜蒌中L-瓜氨酸的含量,方法学考察表明该方法适用于瓜蒌中L-瓜氨酸的含量测定。此外,韩琳娜等[27]利用氨基酸自动分析仪对10个山东栽培瓜蒌样品中的水解氨基酸和游离氨基酸总量进行了含量测定。天花粉含有大量的氨基酸,其中γ-氨基丁酸和瓜氨酸是主要的具有生理调节作用的物质,陈阿虹等[28]采用快速液相色谱-串联质谱法同时测定栝楼桂枝颗粒中γ-氨基丁酸和瓜氨酸的含量。

天花粉蛋白是从栝楼块根中提取出的一种碱性蛋白,为单链核糖体失活蛋白。天花粉蛋白具有抗肿瘤、抗病毒、免疫调节等多种药理活性。当前天花粉蛋白的分离方法有丙酮分级沉淀、离子交换层析、凝胶过滤法。但由于天花粉化学成分复杂,常常将多种纯化方法结合起来分离纯化天花粉蛋白。杨烨等[29]经硫酸铵分级沉淀结合Blue-SepharoseCL 6B和S-Sepharose两步层析法获得TCS纯制剂。马翠丽等[30]采用硫酸铵沉淀、离子交换层析和分子筛层析纯化新鲜栝楼根中的天花粉蛋白。汪苗苗等[31]对比分析了盐析法和亲和双水相分离法,由凝胶电泳结果可知亲和双水相分离出的只有一条区带,可认作为纯品,而盐析法仅使用于药品纯度要求不高的大批量生产。据报道,天花粉蛋白的含量测定方法有考马斯亮蓝紫外比色法和竞争ELISA方法。张波等[32]用考马斯亮蓝紫外比色法测定雌、雄株天花粉蛋白质含量,发现雄株含量高,建议雄株根入药优于雌株。冯成强等[33]建立竞争ELISA方法检测天花粉真伪品中的天花粉蛋白含量,结果发现伪品中均未检出天花粉蛋白。这均为利用天花粉蛋白控制天花粉的内在质量提供了基础。天花粉凝集素是一种糖蛋白,研究表明其具有明显的降糖活性。仅有一篇文献报道报道了天花粉凝集素的提取工艺:李琼等[34]采用单因素及正交试验对料液比、提取时间、提取缓冲液pH和NaCl浓度等提取因素进行优化,确定最佳提取工艺参数。2.3 黄酮及其苷类 中药黄酮类化合物具有广泛的生物活性,如抗肿瘤、抗炎、抗氧化、免疫调节、抗衰老、镇痛及保肝等,而且对心血管和消化系统有显著的药效。李爱峰[35]认为槲皮素-3-O-β-芸香糖苷、木犀草素和芹菜素的扩张冠状动脉、祛痰、止咳、抗动脉硬化、抗菌等生理活性与栝楼果皮润肺化痰、利气宽胸等功效基本一致。瓜蒌子、瓜蒌皮、瓜蒌和天花粉中黄酮及其苷类有效部位的研究主要有提取工艺的优化、化学成分的分离鉴定等。提取工艺的优化主要包括提取方法、提取溶剂、溶剂用量、提取时间和提取温度等。但即使采用最优工艺进行提取,总黄酮量得率仍比较低[36-37]。孙晓业等[38]采用柱层析和制备液相色谱分离纯化95%乙醇提取物,可得到金圣草黄素、4'-羟基黄芩素。李爱峰等[35,39]对栝楼果皮进行化学成分分析,从乙酸乙酯部位分离出的黄酮类成分有槲皮素、木犀草素、芹菜素、香叶木素及其苷类。目前,瓜蒌子、瓜蒌皮、瓜蒌和天花粉总黄酮的含量测定方法主要是紫外分光光度法,还没有关于其单个黄酮及其苷类有效成分进行含量测定的研究,这与总黄酮得率低有关。

2.4 皂苷类 三萜皂苷具有抗癌、降血糖、降血脂、保肝、抗病毒等生物活性。陈颖等[40]报道栝楼中的皂苷主要为羊毛甾烷型的四环三萜和齐墩果烷型的五环三萜类化合物,同时还检测天花粉总皂苷对DPPH自由基的清除能力,认为其具有体外抗氧化活性。李晓芳等[41]探讨天花粉降血糖活性成分的分离和活性时,从80%乙醇洗脱组分得到一个可能为天花粉降血糖治疗糖尿病的活性化合物,其基本骨架为四环三萜类。国外学者从天花粉的甲醇提取物中分离鉴定出8种葫芦烷三萜类化合物并发现这8种葫芦素类化合物对培养的人肿瘤细胞株均有显著的毒性作用[42]。为提高总皂苷的提取率,盛桂华等[43-45]通过比较提取方法、提取溶剂(乙醇的体积分数)、溶剂用量、提取时间、提取温度等优化总皂苷提取工艺。当前研究认为栝楼仁三醇是瓜蒌子的专属性成分,可以作为其内在质量控制指标。刘金娜等[46]以瓜蒌子中3,29-二苯甲酰基栝楼仁三醇的含量为考察指标,比较不同果实成熟度及加工方式对瓜蒌子质量的影响,以期为瓜蒌子的采收和加工提供科学依据。

2.5 脂肪酸类 栝楼籽油对羟基自由基能力和超氧阴离子自由基有较好的清除作用,说明其具有抗氧化作用。瓜蒌子脂肪酸类的提取方法、组分分析为经常报道的两方面。常见的瓜蒌子脂肪酸的提取方法有索氏提取法、超声波提取法、微波提取法、超临界CO2萃取法。通过设计正交试验法或响应面法优化提取参数,得到最佳工艺。李福星等[47-48]分别采用气相色谱法和气相色谱质谱联用技术分析瓜蒌子脂肪酸类的组成成分,得出亚油酸、亚麻酸是瓜蒌子不饱和脂肪酸的主要组成成分。脂肪酸类报道多为瓜蒌子中的脂肪酸类,瓜蒌皮、天花粉中相关报道较少。

通过综述栝楼不同药用部位的有效组分的化学成分、提取及分离纯化方法和含量测定的研究发现:有效组分的药理活性与瓜蒌子、瓜蒌皮、瓜蒌和天花粉的功效相关性不强,多糖类、天花粉蛋白有效部位的提取及分离纯化方法和含量测定水平仍有待提高。因此,应继续开展各药材有效成分的研究,为饮片和相关制剂质量标准的完善提供技术支撑。

3 小结与讨论

瓜蒌子、瓜蒌皮、瓜蒌和天花粉的安全性研究既要重视内源性有毒有害物质的含量测定,又要加强外源性污染物的检测。由于各药用部位内源性有毒有害物质含量差异大,若执行同一个限量标准,势必会制约到药材及相关制剂的临床应用,所以应分别制定各药材的限量标准。外源性污染物的检测不应仅局限于研究农药残留检测,应与药材采收、加工、贮存、流通各环节可能涉及的农药残留、重金属残留、二氧化硫残留、有机污染物、掺假等实际情况紧密结合,在检测时才能“有的放矢”,从而切实保证该类药材、饮片和相关制剂的用药安全。

瓜蒌子、瓜蒌皮、瓜蒌和天花粉有效组分的化学研究与药理研究不能相互对应导致至今仍没有疗效确切、结构确定的化学成分指标来控制其内在质量。在今后的研究中,应将各有效组分化学成分的分离鉴定、含量测定和与功效对应的生物活性有机结合起来,明确各药材的药效物质基础,使化学成分的含量和药材的质量相关,完善各药材的质量评价体系。此外,在筛选控制药材有效性的化学成分指标时,不仅要关注其药理活性,还应考虑其在药材中的含量,否则会严重降低所制定质量标准的可行性。

瓜蒌子、瓜蒌皮、瓜蒌和天花粉为多基原药材,而当前的研究几乎都集中于栝楼(TrichosantheskirilowiiMaxim.)。因此,应在栝楼的研究基础上加强双边栝楼(TrichosanthesrosthorniiHarms)各药用部位的安全性及有效性研究,为各药材更科学全面的质量标准的建立提供依据。

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