不同肉质颜色萝卜ANS基因表达差异分析

刘红芳，陈发波，李文博，方 平

(长江师范学院 现代农业与生物工程学院，重庆 涪陵 408100)

萝卜(RaphanussativusL.)属于十字花科(Brassicaceae)萝卜属(Raphanus)萝卜种，是我国第二大蔬菜类作物。除作为蔬菜食用外，有的萝卜品种还是提取天然色素的理想原料，如胭脂萝卜。胭脂萝卜又名红心萝卜，主产于重庆市涪陵区及邻近区县，是涪陵的第二大特产[1]。从胭脂萝卜中提取的萝卜红色素不仅可以作为食品添加剂，还具有抗氧化、抗痛风等药用功效，其应用前景广阔。从分子水平解析胭脂萝卜红色素合成的机制，可以为通过基因工程手段提高胭脂萝卜色素含量提供理论，对开发和利用胭脂萝卜具有重要意义。我国学者先后对胭脂萝卜的品种选育、相关性状遗传和萝卜红色素的提取等方面开展了研究。陶红英等[1]对胭脂萝卜根部性状进行了研究，结果表明，胭脂萝卜色素含量与其肉质根皮厚度呈正相关。王丽霞等[2]研究了胭脂萝卜肉质根生长中的过氧化物同工酶含量的变化规律，结果表明，过氧化物同工酶有提高萝卜产量的作用，且与萝卜花青素的形成有着密切联系。刘海军等[3]提出了以乙酸溶液浸提辅以超声波法来提取优质萝卜红色素的方法，进一步优化了生产中萝卜红色素的提取方法。花青素(Anthocyanin)是植物次级代谢的重要产物，属于天然色素中的一种，其存在形式为花色苷，在27科72属的开花植物(被子植物)中广泛存在[4]。花青素有许多功能，比如预防紫外线损伤、预防病原体和吸引昆虫传播花粉等[5]。花青素合成酶(Anthocyanid in synthase,ANS)最初是在玉米的A2突变体中克隆得到的，催化无色的原花色素氧化产生有色的花色素，大多数ANS基因由2个外显子和1个内含子组成，且剪切位点都一致[6]。SHI等[7]分析了不同颜色武当木兰花瓣中ANS基因的表达量，表明红色花瓣中其表达量是白色花瓣的26倍。赵志常等[8]通过对芒果ANS基因的克隆及其序列分析发现，芒果花色素苷合成代谢途径中至关重要的基因包括ANS基因，其对芒果果皮红色的形成具有重要作用。目前，对胭脂萝卜的研究主要集中在新品种选育、相关性状遗传和萝卜红色素的提取等方面，而有关萝卜颜色控制基因的研究相对较少，ANS基因是花青素生物合成途径后期非常重要的基因。鉴于此，分析不同肉质颜色萝卜ANS基因表达量与色素含量的相关关系，可为通过基因工程选育高色素含量萝卜品种提供依据。

1 材料和方法

1.1 供试材料

供试材料为16份不同肉质颜色萝卜品种，由长江师范学院提供，材料编号及相关表型性状见表1。

1.2 萝卜肉质根色素含量的测定

按照陶红英等[1]的方法测定萝卜肉质根的色素含量，将新鲜的萝卜肉质根对分成2份，1份用于含水量的测定，另外1份用于色素含量的测定。提取胭脂萝卜肉质根汁液，在 520 nm下测定吸收值，制作标准曲线。1 000 g萝卜肉质根的色素含量C(‰)=V×y。其中，汁液容积V(mL)=1 000×肉质根含水量(%)，汁液质量浓度y(g/mL)由标准曲线的回归方程计算。

表1 16份不同肉质颜色萝卜性状

1.3 萝卜ANS基因表达量的测定

1.3.1 萝卜肉质根总RNA的提取 采用柱式植物总RNA抽提纯化试剂盒SK8661提取萝卜肉质根总RNA，试剂盒由上海生工生物工程有限公司提供。

1.3.2 反转录cDNA 使用第1链cDNA合成试剂盒，反转录合成ANS基因第1链cDNA。在0.2 mL PCR管中加入总RNA 5 L、随机引物p(dN)6(0.2 g/L)1 L和无RNA酶ddH2O 5 L，放入70 ℃温度下水浴5 min后，转入到 0 ℃下冰浴10 s。然后加入反应缓冲液4.0 L、10 mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸混合液2.0 L、20 U/L核糖核酸酶抑制剂1.0 L和10 U/L逆转录酶2.0 L。于37 ℃温度下水浴5 min，再在42 ℃下水浴60 min，最后70 ℃水浴10 min终止反应。

1.3.3 荧光定量PCR检测 管家基因引物序：actin-F:5′-TATGAGCAAAGAGATCACAGCACT-3′；actin-R:5′-TGAGGGAAGCAAGAATGGAA-3′，目的基因引物序列：ANS-F:5′-TACATTGAAGCGACGAG-TGAGT-3′；ANS-R:5′-AGGGC-ATTTCGGGTAATA-GTT-3′，引物由上海生工生物有限公司合成。将已合成的cDNA样品作8倍稀释处理后作为模板上机检测。反应混合液见表2，在ABI Stepone plus型荧光定量PCR仪中进行反应，反应程序：95 ℃预变性120 s，95 ℃变性10 s，60 ℃退火40 s，40个循环。

表2 荧光定量PCR反应混合液

1.4 数据处理

采用2-ΔΔCt法对萝卜ANS基因含量进行相对定量分析，采用DPS软件和Excel 2010软件进行相关图表的制作、方差分析和相关性分析。

2 结果与分析

2.1 不同萝卜品种色素含量分析

对16份不同肉质颜色萝卜色素含量进行方差分析(表3)，结果表明，16份萝卜色素含量存在极显著差异(F=114.294 0，P=0.000 1)。图1显示，14号萝卜色素含量最高，为25.43‰，15号和16号萝卜次之，色素含量分别为23.48‰和22.58‰，而2号、3号和4号萝卜几乎不含色素。

表3 16份萝卜色素含量方差分析

注：**表示在0.01水平差异显著,下同。

Note:** indicate significance at the 0.01 level,the same below.

不同字母表示在0.05水平差异显著，下同

根据表1中肉质根皮色及肉质颜色，将16份不同肉质颜色萝卜分为5种类型，即白皮白心、红皮白心、绿皮花心、红皮花心和红皮红心。对5种类型萝卜色素含量进行方差分析(表4)，结果表明，5种类型萝卜色素含量存在极显著差异(F=255.925 0，P=0.000 1)。图2显示，红皮红心萝卜色素含量最高，为23.80‰，红皮花心萝卜次之，色素含量为7.00‰，白皮白心萝卜色素含量最低，仅为0.10‰。红皮红心萝卜色素含量显著高于其他类型萝卜。

表4 5种类型萝卜色素含量方差分析

A：白皮白心；B：红皮白心；C：绿皮花心；D: 红皮花心；E：红皮红心,图4同

2.2 不同萝卜品种ANS基因表达量分析

对16份不同肉质颜色萝卜ANS基因表达量进行方差分析(表5)，结果表明，16份不同肉质颜色萝卜间ANS基因表达量存在极显著差异(F=95.984 0，P=0.000 1)。图3显示，14号萝卜ANS基因表达量最高，为9.173 0，其次为16号萝卜(7.143 9)，2号、3号和4号萝卜ANS基因表达量最低，分别为0.142 9、0.109 3和0.090 9。

对5种类型萝卜ANS基因表达量进行方差分析(表6)，结果表明，5种类型萝卜间的ANS基因表达量存在极显著差异(F=137.995 0，P=0.001)。图4显示，红皮红心萝卜的ANS基因表达量最高(6.439 0)，其次为红皮花心萝卜(1.303 0)、绿皮花心萝卜(1.239 0)、红皮白心萝卜(0.709 0)和白皮白心萝卜(0.126 8)，红皮红心萝卜的ANS基因表达量显著高于其他类型萝卜。

表5 16份萝卜ANS基因表达量方差分析

图3 16份不同类型萝卜ANS基因表达量

表6 5种类型萝卜ANS基因表达量方差分析

Tab.6 Variance analysis ofANSgene expression level in five types of radish

变异来源Source of variationSSdfMSFP区组间Block2.532 321.266 11.664 00.248 7处理间Treatment419.974 54104.993 6137.995 0∗∗0.000 1误差Error6.086 880.760 9总变异Total428.593 614

图4 5种类型肉质根中ANS基因表达量

2.3 ANS基因表达量与萝卜色素含量的相关性分析

利用DPS软件对萝卜ANS基因表达量与萝卜色素含量进行相关性分析，结果表明，萝卜ANS基因表达量与萝卜色素含量相关系数为0.83，且达到极显著水平，说明萝卜ANS基因与萝卜色素含量密切相关。

3 结论与讨论

天然色素与人工合成色素相比有许多突出优点，比如安全性高、低毒副作用、毒理学评价不高等[7]。花青素是重要的天然色素，其应用广泛。而ANS基因在花青素生物合成途径的后期起着重要作用，它能够依赖2-酮戊二酸离子和二价铁离子将无色的花青素催化成显色的花青素[8-11]，这使ANS基因与花青素生物合成关系方面的研究成为近年来科学研究的热点。冯文亭[12]对红早酥梨花色素苷合成相关基因进行克隆及功能研究，结果表明，ANS基因是花色素苷生物合成重要的结构基因。王雪等[13]通过对苹果梨果皮花色素苷合成相关基因PyANS的克隆与表达进行分析，认为PyANS基因对果实花色素苷积累有一定的促进作用。孙梓健[14]研究发现，不同叶色根用芥菜中ANS基因的表达量与花青素的积累有密切关系，ANS基因在红叶芥叶片中的表达量要比绿叶芥叶片中的高。胭脂萝卜是提取天然色素的理想材料，但对其色素合成的分子机制研究报道相对较少。本研究结果表明，16份不同类型萝卜间肉质根ANS基因的表达量和色素含量均存在极显著差异，且红皮红心萝卜的ANS基因表达量和色素含量均显著高于其他类型萝卜。相关性分析，不同类型萝卜ANS基因表达量与色素含量呈极显著正相关，且相关系数较大(0.83)，表明ANS基因可在萝卜色素生物合成中扮演重要角色，在接下来的研究中可以重点克隆胭脂萝卜ANS基因，并开展其分子作用机制研究，进而通过转基因手段提高萝卜色素的产量。