日本血吸虫多肽SJMHE1对关节炎小鼠的毒副反应检测

王 钧,汪雪峰

(1.镇江市第一人民医院检验科，江苏 镇江 212002；2.江苏大学附属医院中心实验室，江苏 镇江 212001)

“卫生假说”认为，目前发达国家自身免疫或过敏性疾病的增加与环境卫生条件的改善、抗生素的大量使用等导致其幼年时获感染的概率下降密切相关[1]。流行病学调查显示，病原体感染特别是蠕虫感染与自身免疫或过敏性疾病存在相反的关系，蠕虫感染的流行区，自身免疫或过敏性疾病的发病率较低，反之亦然[2]。从史前木乃伊中发现的蠕虫证实了蠕虫感染参与人类的整个进化过程[3-4]。与人类共进化的蠕虫可通过抑制宿主的免疫反应达到长期寄生的目的，为自身免疫或哮喘等炎症性疾病的治疗提供了新的研究方向。近年来研究发现，蠕虫感染或蠕虫来源的免疫调节分子可预防或治疗多种自身免疫或过敏性疾病的模型小鼠，如1型糖尿病、炎性肠病、哮喘等[5]。本研究前期实验发现，日本血吸虫来源多肽SJMHE1可抑制小鼠迟发性超敏反应[6-8]，减轻胶原诱导的关节炎小鼠的炎症反应[9]。因此，具有抗炎效应的此日本血吸虫来源多肽具有广泛的临床应用前景，本研究主要检测该小分子多肽注射到关节炎小鼠后可能的毒副反应，为今后的临床转化提供必要的实验依据。

1 材料与方法

1.1材料 60只6～8周龄的雄性DBA/1小鼠购自南京大学实验动物中心，动物合格证号：SCXK(苏)2010-0001。小鼠均在江苏大学实验动物中心饲养，无特定病原体级管理。所有动物实验遵照江苏大学动物保护和使用委员会指南及协议。SJMHE1、卵清蛋白323-339多肽(ovalbumin,OVA323-339)购自中国淘普生物公司；牛 Ⅱ 型胶原购自美国BD Bioscience公司；完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂购自美国Sigma公司；结核分枝杆菌购自美国Difco公司。

1.2方法

1.2.1建立胶原诱导的关节炎小鼠(collagen-induced arthritis，CIA)模型 参照文献[9]的研究，200 μg牛Ⅱ型胶原与完全弗氏佐剂等量混合，制成乳化剂，在0、21 d尾根部皮下免疫DBA/1小鼠，共免疫2次。完全弗氏佐剂由不完全弗氏佐剂中加4 mg/mL的结核分枝杆菌H37RA配制，并经关节炎症的临床评分及组织学鉴定，验证CIA小鼠的构建成功。

1.2.2CIA的临床评定 每天监测小鼠关节炎的症状，观察到一个脚爪出现红斑或肿胀，视为关节炎开始发病，并进行临床评分，关节炎的严重程度分0～3个等级：0级为无改变，1级为轻微肿胀和(或)红斑，2级为中度肿胀和红斑，3级为显著的肿胀和红斑；根据4个脚爪的炎症状况，每只小鼠最高评分为12分[9]。

1.2.3组织学鉴定 在牛Ⅱ型胶原免疫的第55天，分离各治疗组小鼠的膝关节，10%的甲醛固定24 h后，用5%的三氯乙酸脱钙7 d，然后脱水，石蜡包埋，制成3～4 μm的切片，苏木精-伊红染色后显微镜检查组织学改变。

1.2.4SJMHE1处理CIA小鼠 60只小鼠依据随机数字法分为Naive组、SJMHE1组、OVA323-339组、磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution，PBS)组及 CIA组，每组12只；将10 μg SJMHE1、10 μg OVA323-339、PBS与完全弗氏佐剂等量混合，制成乳化剂，尾脊部皮下注射小鼠，注射剂量100 μL/只；在牛Ⅱ型胶原免疫的第7天进行小鼠皮下免疫，每隔14天免疫一次，共注射3次。

1.2.5小鼠血细胞、血清生化指标测定 在SJMHE1皮下免疫8周后，小鼠眶内眦取血进行白细胞计数和血清生化指标检测，包括小鼠肝脏功能指标(丙氨酸转氨酶与天冬氨酸转氨酶)和肾脏功能指标(尿素氮、尿肌酐)，采用日本奥林巴斯Au2700全自动生化仪进行检测。

1.2.6小鼠组织病理切片观察 分离各处理组小鼠肝脏、肾脏、肺脏、心脏，随即放入装有10%甲醛固定液的标本瓶中浸泡固定48 h后做病理组织学检查，苏木精-伊红染色，光镜观察各个器官组织形态学变化。

2 结 果

2.1CIA小鼠关节炎症的病理改变 OVA323-339组、PBS组和CIA组小鼠的脚爪病理出理大量炎症细胞浸润，滑膜增生，关节间隙明显变窄，有血管翳，软骨有侵蚀和破坏；但SJMHE1处理小鼠关节炎症细胞的浸润及软骨破坏最轻，与Naive组小鼠相同，其关节滑膜完整，滑膜细胞1～2层，排列整齐，软骨完整。见图1。

Naive:正常对照；OVA323-339：卵清蛋白323-339多肽；PBS：磷酸盐缓冲液；CIA：胶原诱导的关节炎

2.2SJMHE1处理对白细胞计数的影响 Naive组、SJMHE1组、OVA323-339组、PBS组、CIA组白细胞计数分别为(1.85±0.07)×109/L、(1.95±0.21)×109/L、(4.12±1.13)×109/L、(3.70±1.11)×109/L、(5.10±1.27)×109/L，各组比较差异有统计学意义(F=14.320,P<0.01)，OVA323-339组、PBS组、CIA组小鼠的白细胞计数高于Naive组(P<0.05)，但SJMHE1组白细胞计数与Naive组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3SJMHE1处理对小鼠血清生化指标的影响 各组小鼠ALT、AST、BUN、Cr比较差异均无统计学意义(P>0.05),见表1。

2.4SJMHE1处理对主要脏器的影响 Naive组、SJMHE1组、OVA323-339组、PBS组及CIA组小鼠肝小叶结构清晰完整，肝细胞形态结构正常(图2)；各组小鼠肾脏结构正常，可见泌尿小管、少量血管神经等构成的肾间质，肾小管上皮细胞完整(图3)；各组小鼠肺组织中肺泡结构完整，肺泡腔和支气管干净，有少量红细胞(图4)；各组小鼠心肌组织结构完整、清晰，心肌纤维细长，心肌纤维间有少量组织(图5)；SJMHE1处理未见小鼠肝脏、肾脏、肺脏、心脏出现异常。

表1 各组小鼠血清生化指标比较

Naive:正常对照；OVA323-339：卵清蛋白323-339多肽；PBS：磷酸盐缓冲液；CIA：胶原诱导的关节炎

Naive:正常对照；OVA323-339：卵清蛋白323-339多肽；PBS：磷酸盐缓冲液；CIA：胶原诱导的关节炎

Naive:正常对照；OVA323-339：卵清蛋白323-339多肽；PBS：磷酸盐缓冲液；CIA：胶原诱导的关节炎

Naive:正常对照；OVA323-339：卵清蛋白323-339多肽；PBS：磷酸盐缓冲液；CIA：胶原诱导的关节炎

Naive:正常对照；OVA323-339：卵清蛋白323-339多肽；PBS：磷酸盐缓冲液；CIA：胶原诱导的关节炎

3 讨 论

蠕虫感染或蠕虫来源的免疫调节分子可抑制多种自身免疫、过敏等炎症反应。如曼氏血吸虫、蛔虫的磷脂酰丝氨酸[10]、魏氏棘唇线虫的排泄-分泌物ES-62等均可以通过Toll样受体抑制血友病A、关节炎、系统性红斑狼疮、哮喘等[11-14]。但目前大多数已鉴定出的蠕虫免疫调节分子多为蛋白大分子、糖脂、糖蛋白混合物，具有潜在的免疫原性副反应[15-16]。血吸虫感染也可加剧过敏性疾病的发病，除血吸虫感染可诱导Th2细胞极化反应外，血吸虫本身含有的过敏原也可加剧过敏性疾病的发病[17-18]。因而，为了减少蠕虫分子抗炎治疗带来的不良反应，一些研究者开始寻求蠕虫分子的小分子类似物，如来自ES-62的小分子类似物已被证明可抑制哮喘和关节炎等[14,19-20]。与上述寻求蠕虫小分子类似，本课题组致力于寻求蠕虫抗原的小分子多肽，期待其具有抗炎效应的同时，提高治疗过程中的安全性。

另外，类风湿关节炎是一种慢性炎症性疾病，影响全球约1%的人口，我国发病率为0.3～0.5%，类风湿关节炎的致残率较高，未经治疗的类风湿关节炎患者2～3年致残率高达70%[21]，由此造成丧失劳动能力的人群高达千余万，已成为一种严重威胁人类健康的疾病。类风湿关节炎的主要病理特征为滑膜增生，炎症细胞浸润、血管翳形成，关节软骨及软骨下破坏等。目前类风湿关节炎的临床治疗仍以非甾体抗炎药物和慢作用抗风湿药物为主，糖皮质激素和细胞毒免疫抑制剂也较常用，这些药物均有一定疗效，但由于不良反应较大，患者难以长期服用。因此，急需寻求新的特异性作用靶点或新的干预手段对类风湿关节炎患者进行治疗，开发毒性小且能有效治疗的药物不仅具有重要的社会效益，还将产生重大的经济效益。

目前关于蠕虫感染或蠕虫产物治疗关节炎的报道也较多，如日本血吸虫感染可抑制小鼠胶原诱导的关节炎的发生，减轻关节炎的临床症状，减少滑膜增生，减少滑膜炎症细胞的浸润，减少血管翳的形成及破骨细胞活化，减少关节破坏[22]。旋毛虫感染的小鼠胶原诱导关节炎的发生率明显降低；旋毛虫感染可经程序性细胞死亡受体1介导，减少致炎性Th1/Th17细胞反应，显著减轻小鼠关节炎的病理改变[23]；猪蛔虫的提取物口服或皮下注射，也可抑制小鼠酵母聚糖和胶原诱导的关节炎的发生，减少软骨增生及破坏[24]。因为蠕虫感染易引起较多的不良反应，更多的研究者也在关注蠕虫分子对关节炎的抑制效应，其中研究最多、最广泛是魏氏棘唇线虫的ES-62，ES-62可通过调节肠道微生物和肠黏膜屏障的完整[11]，抑制Th17和γδT细胞依赖的白细胞介素-17产生，抑制小鼠胶原诱导的关节炎的发生[25]；由于ES-62为大分子，为了减少大分子可能的免疫原性不良反应，其小分子类似物也被证明可抑制炎症性关节炎和破骨细胞生成[19]。因为目前尚未发现蠕虫来源多肽在关节炎小鼠中的毒副反应检测，本研究对关节炎小鼠的安全性检测参照药物或疫苗的检测指标及方法[26-27]。本研究结果显示，关节炎小鼠的脚爪病理出理大量炎症细胞的浸润，滑膜增生，关节间隙明显变窄，有血管翳，软骨有侵蚀和破坏，说明关节炎小鼠模型构建成功，但SJMHE1处理的小鼠关节炎症细胞的浸润及软骨破坏最轻，与Naive组小鼠类似，关节滑膜仍保持完整。该结果与小鼠白细胞计数结果一致，与OVA323-339、PBS及CIA组小鼠相比，小鼠皮下注射血吸虫多肽SJMHE1，可明显减少外周血中白细胞计数，表明SJMHE1可抑制关节炎小鼠的炎症反应；与Naive组小鼠相比，SJMHE1处理不会引起肝、肾主要生化酶学的升高，表明SJMHE1处理不会引起明显的肝、肾功能损害；同时，不会引起小鼠主要脏器肝脏、肾脏、肺脏、心脏组织的病理学改变。全程无小鼠死亡，未见小鼠摄食减少、体重下降等不良反应，表明该小分子多肽具有应用的安全性，可为今后进一步开展基于此小分子多肽的治疗关节炎等炎症性疾病的临床前研究提供依据，也为类风湿关节炎的治疗提供新的靶点和依据。

综上所述，日本血吸虫来源多肽SJMHE1可抑制胶原诱导的关节炎小鼠的炎症反应，但不影响小鼠的肝、肾功能，对小鼠肝脏、肾脏、肺脏、心脏组织无明显影响，具有较好的生物安全性。