大鼠GABAA受体β2亚基真核表达质粒的构建及鉴定

王彦玲 刘永 刘英奎 胡书群

摘  要：目的：构建并鉴定大鼠GABAAR（γ-氨基丁酸A受体）β2亚基真核表达质粒。方法： 以大鼠GABAARβ2亚基基因的cDNA序列为依据设计上游、下游引物，以大鼠总RNA为模板，RT-PCR扩增目的基因片段，经T载体定向克隆至真核表达载体pcDNA3.1（+），酶切后电泳、测序检测克隆情况。将阳性克隆质粒转染至HEK293细胞，免疫印迹检测蛋白表达情况。结果：GABAARβ2亚基基因扩增成功，并被连接至pcDNA3.1（+），且测序结果与所查CDS序列一致。免疫印迹结果显示，转染后的细胞采用WB方法检测到过表达的GABAARβ2蛋白。结论：β2-pcDNA3.1（+）真核表达质粒构建成功，并可在HEK293细胞中过表达。

关键词：GABAA受体;真核表达;质粒构建

中图分类号：Q784  文献标识码：A  文章编号：1671-2064（2019）16-0000-00

GABAAR（γ-氨基丁酸A受体）是由5个亚基组成的异质寡聚体跨膜糖蛋白，已鉴定的亚基有：α1-α6、β1-β3、γ1-γ3、δ、ε、π、θ及ρ1-ρ3^[1]，他们组成不同的亚型发挥生理作用。α1β2γ2类型是大脑中含量最丰富的亚型^[2]。

研究显示，β2亚基与多种疾病和生理活动相关，但是有关β2亚基在GABAAR功能调控中的作用机制仍然有待研究。本研究拟采用RT-PCR技术获得大鼠GABARβ2亚基cDNA，并构建其真核表达质粒，为GABAAR的功能研究提供分子基础。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1主要试剂

总RNA提取试剂盒购自Promega公司，RT-PCR试剂盒购自Takara公司，限制性内切酶BamH I、EcoR I和T4 DNA连接酶购自NEB公司;PCR引物委托上海生工生物工程股份有限公司合成;羊抗GABAAR β2抗体和驴抗羊IgG-HRP购自Santa Cruz Biotechnology公司。

1.1.2菌株、质粒及细胞

DH-5α大腸杆菌感受态细胞、pcDNA3.1（+）、GABAAR α1-pcDNA3.1（+）、γ2-pCMS-EGFP质粒及HEK293细胞均由江苏省脑病生物信息重点实验室提供。

1.2方法

1.2.1引物设计、总RNA提取及目的基因扩增

根据大鼠GABAARβ2的编码序列（NM_012957），在其上下游分别设计特异性引物。序列如下：

P1： 5-GGATCCGCCACCATGTGGAGAGTCCGG-3，

P2： 5-CGGAATTCTTAGTTCACATAGTAAAGCC-3.

依RNA提取试剂盒操作流程，提取大鼠海马总RNA，并以之为模板，加入P1、P2引物，RT-PCR扩增目的基因，1%琼脂糖凝胶电泳回收纯化。

1.2.2 β2-T vector克隆载体的构建

纯化的β2基因片段连接pGEM-T vector，转入DH5α感受态细胞，琼脂培养基筛选阳性克隆。选取单菌落提取质粒，经BamH I、EcoR I双酶切、琼脂糖凝胶电泳检测片段大小，并委托南京金斯瑞公司进行测序。

1.2.3 β2-pcDNA3.1（+）真核表达载体的构建

测序正确的重组克隆载体质粒和pcDNA3.1（+）行BamH I、EcoR I双酶切，并分别纯化。纯化的目的片段亚克隆入pcDNA3.1（+），转化、筛选阳性克隆，行BamH I、EcoR I双酶切及测序鉴定。将测序正确的重组质粒大量制备，用于细胞转染。

1.2.4 HEK293细胞培养与转染

细胞于含10%胎牛血清的DMEM培养基^[3]，37℃、5% CO₂条件下恒温培养。细胞密度适宜时，重组质粒与 α1-pcDNA3.1（+）、γ2-pCMS-EGFP质粒PEI法共转染入细胞。48 h后收集细胞。

1.2.5 蛋白含量测定

收集的细胞超声破碎后，采用BCA法，以牛血清白蛋白为标准蛋白测定蛋白浓度。

1.2.6免疫印迹检测GABAARβ2蛋白的表达

50 μg蛋白样品经SDS-PAGE分离，半干转至PVDF膜上。3% BSA 孵育4 h后，羊抗GABAAR β2抗体4℃孵育过夜，HRP（辣根过氧化物酶）标记的二抗工作液室温孵育45 min，增强化学发光法 （ECL） 试剂盒显色。

2 结果与分析

2.1 GABAARβ2-pcDNA3.1（+）真核表达载体构建

1%琼脂糖凝胶电泳结果显示：提取的总RNA 18 S、28 S条带明亮，且28S条带亮度约为18 S条带亮度的两倍，表明提取的RNA完整性良好（图1A）。RT-PCR扩增产物在约1400 bp附近有一明亮条带，与 β2亚基（14245bp）分子量大小一致。（图1B）。β2-T vector双酶切产物呈现两条条带，分别在约3000bp和1400bp处，与T vector（3000bp）和 β2亚基分子量大小相符（图1C）;β2-pcDNA3.1（+）双酶切产物在约5000 bp和1400 bp处分别有一明亮条带，与pcDNA3.1（+）（5400bp）和 β2亚基分子量大小相符（图1D）。经测序分析，被测基因序列与所查的CDS序列完全一致。结果表明，GABAAR β2-pcDNA3.1（+）真核表达载体构建成功。

M：1Kb DNA marker; 1：GABAARβ2亚基PCR/双酶切产物。

Cell： 空细胞组;vector： 转染空载体组;αβγ： α1β2γ2质粒共转染组

2.2 蛋白表达鉴定

免疫印迹结果显示，转染组可检测到显著的β2蛋白条带（图2）。表明构建的 β2-pcDNA3.1（+）真核表达质粒可在HEK293细胞中高效表达。

3 讨论

近几年，对于β2亚基功能的研究日益增多。有研究表明，在酒精依赖中，β2亚基发挥了重要作用^[4]。β2亚基还参与了低频电刺激对癫痫的治疗^[5]。本研究成功构建了GABAAR β2亚基的真核表达质粒，并可在HEK293细胞中表达。通过与其它亚基质粒的共转染，可在分子水平研究GABAAR及其β2亚基的功能。

参考文献

• Simon，J; Wakimoto，H;Fujita，N; et al. Analysis of the set of GABA（A） receptor genes in the human genome[J].J Biol Chem，2004，279（40）：41422-41435.
• Deniz， S; Wersinger， E; Picaud， S; et al. Evidence for functional GABAA but not GABAC receptors in mouse cone photoreceptors[J].Vis Neurosci，2019，36：E005.
• 岳軍，齐素华.p38α半胱氨酸点突变体真核表达载体的构建和表达[J].实验室科学，2015，18（01）：19-21.
• 孙利净，韩秋月，胡满.γ-氨基丁酸（GABA）受体的研究进展[J].黑龙江畜牧兽医，2016（07）：80-83.
• 杨光明，王峰，李杨，等.海马低频电刺激对KA点燃大鼠GABAA受体α1和β2亚基表达的影响[J].中华医学杂志，2014，5：382-385.  

收稿日期：2019-06-21

*基金项目：江苏省自然科学基金（BK20181471）;江苏省普通高校研究生科研创新计划项目（CXLX11_0727）。

作者简介：王彦玲（1987—），女，山东济宁人，硕士，助理实验师，研究方向：缺血性脑病的分子机制和医学检验技术。

通讯作者：刘永（1974—），男，江苏灌云人，博士，副教授，研究方向：神经细胞信号转导。