532激光光凝诱导BN大鼠脉络膜新生血管生成时间探讨※

彭华 王维绮 刘兰 马珊 代超

（1 云南省中医医院眼科，云南 昆明 650021；2昆明医科大学附属口腔医院口腔研究所，云南 昆明 650101）

脉络膜新生血管（choroidal neovescularization，CNV）是由多种病因所致的脉络膜新生血管芽穿越Bruch膜，并在视网膜色素上皮层（RPE）下和（或）感觉上皮层下增殖形成的纤维血管组织，常伴有视网膜下的浆液性渗出和（或）出血，易反复出血，晚期形成瘢痕组织，最终导致患者视力丧失，是眼科临床多种眼底病的共同病理改变，病变主要发生在眼底黄斑区，临床多见于湿性老年性黄斑变性（ARMD）、中心性渗出性脉络膜视网膜病变（CEC）、高度近视脉络膜黄斑出血（HM）等眼底病。因CNV可造成患者视力严重损害，具有不可逆性，是一类常见的致盲性眼病，目前国内外尚无彻底治疗手段，是世界公认的难治性眼底病之一。据统计，世界范围内仅AMD患者就有2000～2500万人，其中80%以上重度视力障碍AMD患者有CNV的形成［1］。如何有效治疗CNV是全球眼科界共同关注的热点问题，故开展CNV的治疗研究，对预防致盲，保障人类健康具有十分重要的意义。因此我们采用523 nm激光击穿Bruch膜的方法建立相关CNV动物模型，观察CNV生成时间，为治疗CNV提供有效的介入时间奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 选择含有色素的BN大鼠25只，雌雄不限，体质量约（170±10）g；由昆明医科大学口腔医学重点实验室提供，动物及实验适用条约符合国家科学技术委员会发布的《实验动物管理条例》。

1.1.2 实验仪器 多波段眼底激光治疗仪532 nm激光机（双子星Viridis-twin，法国光太公司）、眼底血管造影机（德国海德堡HRA/OCT，型号：HRA2-KT-03847）。

1.1.3 实验试剂 复方托吡卡胺滴眼液（北京双鹤现代医药技术有限责任公司）；荧光素钠注射液（Alcon Laboratories，Inc.美国）、水合氯醛（由昆明医科大学口腔医学重点实验室提供）。

1.2 研究方法

1.2.1 造模方法 按照4 mL·kg-1体质量标准腹腔注射100 g·L-1水合氯醛进行麻醉，复方托吡卡胺滴眼液双眼散瞳，盐酸奥布卡因滴眼液（倍诺喜）行眼表麻醉，在全视网膜镜下用半导体激光（波长532 nm），照射部位位于视乳头及髓线下方，以光凝后有气泡产生为击破Bruch膜的标志，激光参数：功率625～750 mW，时间0.1 s，光斑直径50μm，点数30～40。

1.2.2 荧光素眼底血管造影术（FFA）检查 于造模后每周将25只BN大鼠按照1.5 mL·kg-1体质量准腹腔注射100 g·L-1荧光素钠（0.1 mL/100 g），注射后立即计时，并用眼底照相机进行同步动态造影观察视网膜荧光渗漏情况。

1.3 统计学方法 本次实验采用Image-Pro Plus 6.0系统对数字图片进行分析测量，实验数据用（±s）表示；采用SPSS 18.0软件进行完全随机的单因素方差分析，组间两两比较用LSD检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 FFA检查CNV渗漏面积结果532光凝后7～28 d，FFA检查显示CNV渗漏面积呈逐渐增多趋势。在本实验造模的480个激光点中，7 d成模率为57.25%，14 d为68.40%，21 d、28 d达到顶峰，分别为74.00%、78.25%。14 d、21 d、28 d CNV渗漏面积与第7天相比，及14 d与28 d CNV渗漏面积相比，差异均具有统计学意义（P均＜0.05））；而21 d与28 d的CNV渗漏面积比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1 激光光凝后比较不同时间眼底FFA检查中的荧光渗漏面积变化（±s）

表1 激光光凝后比较不同时间眼底FFA检查中的荧光渗漏面积变化（±s）

2.2 眼底FFA结果FFA显示，532光凝后7 d，（图1a）检查示BN大鼠眼底视网膜光凝斑处存在轻度荧光素渗漏，出现少量CNV；激光光凝后14 d，（图1b）FFA检查示眼底视网膜光凝斑处出现中度的荧光素渗漏，CNV面积扩大；532激光光凝后21 d，（图1c）FFA检查示BN大鼠眼底视网膜光凝斑处荧光素渗漏呈大片状，可见强荧光素渗漏，CNV面积进一步扩大；532激光光凝后28 d，（图1d）FFA检查示BN大鼠眼底视网膜光凝斑处荧光素渗漏强度趋于稳定，与第21 d相比无明显变化。

图1 FFA检查光凝后荧光素渗漏情况

3 讨论

脉络膜新生血管（choroidal neovescularization，CNV）常见于年龄相关性黄斑变性（ARMD）、病理性近视、中心性渗出性脉络膜视网膜病变等常见的眼底性疾病，黄斑区域是新生血管主要的好发区，轻度时即可出现视力的下降，严重时常可导致患者视力不可逆的丧失，是一类常见的致盲性眼病，目前CNV产生的机制尚未完全阐明。研究表明CNV是由多种因素共同作用的结果，玻璃膜的增厚、变性、破裂等损害是产生脉络膜来源的新生血管的先决条件［2］。由于正常情况下处于拮抗平衡状态的VEGF因子和抗VEGF因子的平衡受到视网膜脉络膜局部的缺血缺氧，氧化反应、炎性反应等病理破坏，使促和抗血管生成因子在眼内的平衡受到破坏，进而激活了血管系统长出新生血管使脉络膜微循环的障碍及视网膜色素上皮的功能出现异常，Brunch膜破裂，CNV芽穿越Bruch膜，并在RPE层下和（或）感觉上皮层下增殖形成纤维血管组织［3］。由于新生血管促进因子和抑制因子调控着血管的新生，正常情况下，他们处于相对平衡状态，两种因子的平衡使血管处于正常的生长状态，一旦这两种因子中的任何一种因子被打破，就会激活血管系统发芽长出新生血管［4］。

高小燕［5］等通过观察激光光凝术后BN大鼠的病理切片发现，正常BN大鼠视网膜、脉络膜各层组织结构清晰，Bruch膜破裂时间在光凝后1周出现，并伴有少量脉络膜新生血管的形成，之后脉络膜新生血管面积逐渐增加，一直到光凝后8周可见明显CNV形成。唐坤［6］通过采用CD31免疫组化法观察激光光凝术后CNV的生长情况，发现光凝后35 d出现大量完整新生管腔结构，即明显的CNV的形成，而7 d内CNV生长并不明显。据报道［7］采用激光光凝诱导的方法，多数CNV可在2周内生成。陶方方［8］通过观察加减驻景方干预大鼠脉络膜新生血管形成的机制研究发现，采用659 nm氪激光光凝后7 d，CNV开始形成，14 d达到顶峰，21 d CNV逐渐稳定。邹秀兰［9］等采用组织病理学方法观察发现光凝后14 d，在光凝区及附近形成CNV。本实验研究发现532激光光凝诱导BN大鼠CNV动物模型的发生时间在7 d以内，7～21 d迅速进展，21～28 d达到峰值，此后CNV达到稳定，与文献报道结果相似，CNV是严重危害人类健康的重大疾病之一。因此，熟练的掌握CNV出现时间，对于合理的介入药物治疗有至关重要的作用。由于个体等差异，没有准确的观察到CNV形成的具体时间，只能得出一个时间范围，在以后的实验中我们将努力改进实验方法，总结出CNV形成的准确时间，为治疗此病提供先机。