遵义市汇川区特殊教育学校192例耳聋学生耳聋基因检测分析

廖生波，谢天宏，丁 丹，李小英，黄 晗，王世飞

(1.遵义医科大学附属医院 耳鼻咽喉科, 贵州 遵义 563099；2.四川大学华西第四医院 耳鼻咽喉科, 四川 成都 610041；3.河南省周口市中心医院，河南 周口 466000 )

耳聋在人类残疾中最常见，按其发生原因分遗传性和非遗传性，约60%以上的耳聋由于基因或染色体异常等遗传因素引起[1]。根据是否伴有耳外全身其它组织器官疾病把遗传性耳聋分为综合征性耳聋(Syndromic hearing loss，SHL)和非综合征性耳聋(Nonsyndromic hearing loss，NSHL)[2]。国内外研究表明，遗传性耳聋中NSHL占耳聋人群的70%以上，不同种族、民族、地区遗传性耳聋的发病率及发病原因各不相同[3]。各地在开展耳聋基因检测初期，多以最常见4个耳聋致病基因GJB2、SLC26A4、线粒体12SrRNA及GJB3 基因检测开展耳聋基因检测相关研究。我国幅员辽阔，各民族大杂居，小聚居，生活习惯及饮食结构、环境因素等影响，常见耳聋基因检出率报道差异较大，我们对贵州遵义市汇川区特殊教育学校192例耳聋学生进行常见耳聋基因检测，了解本地常见耳聋基因突变情况，为在本地区深入开展遗传性耳聋防治工作奠定基础。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集2012年9月至2016 年9 月就读于遵义市汇川区特殊教育学校的非综合征性耳聋学生192 人，男 113 例，女79 例，年龄5～22 岁，平均(14.80±7.22)岁，其中汉族耳聋学生160 例，少数民族聋哑学生32例[4]。得到遵义市残疾人联合会、特殊教育学校教师大力支持，取得学生及家长同意。纳入标准:①所有研究对象均为两代以上常驻贵州省遵义市辖区；②听力检测证实为中重度、极重度感音神经性非综合征性耳聋;③目前就读于遵义市汇川区特殊教育学校；④有或无耳聋家族遗传史。排除标准：①诊断急、慢性化脓性中耳炎，有中耳手术史者；②有明确可引起听力下降；包括颅面部外伤、脑膜炎、迷路感染等其它疾病史；③伴有外耳、中耳畸形，引起传导性听力下降者；④伴有脑瘫、智力发育障碍、或全身其它疾病影响听力检测效果者；⑤聋哑学生及家长不同意进入该项研究者。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 每位受检对象由护士使用一次性无菌针采血5 mL，-80℃保存，检测时解冻使用DNA提取试剂盒(上海生工生物工程)提取DNA，使用Thermo ND-2000测定DNA浓度与纯度，控制样本纯度OD260/280=1.8～2.1，浓度150 ng/μL左右。

1.2.2 耳聋基因芯片检测 将抽提的DNA取50 ng配置成25 μL体系进行PCR扩增，反应条件为：95℃预变性5 min，95℃变性30 s，55℃复性30 s后72℃延伸30 s，进行30个循环，终止反应后72℃延伸7 min，置于4℃冰箱保存，使用耳聋基因芯片(北京博奥生物有限公司)对本研究中192例患者的耳聋基因突变进行筛查，主要包括GJB2、GJB3、SLC26A4及mtDNA12SrRNA四个常见耳聋基因的9个突变位点。

1.2.3 颞骨颞骨高分辨率 CT 扫描+三维重建 对SLC26A4 基因突变者进行颞骨高分辨率CT+三维重建检查前庭导水管是否有扩大以及病变类型。

2 结果

192例耳聋患者中，基因突变 32例(16.67%，32/192)见表1。

表1192例耳聋学生耳聋基因检出情况

基因类型突变位点检出例数检出率235 delC纯合136.77%(13/192)235 delC杂合31.56%(3/192)GJB2299del AT杂合突变21.04%(2/192)176del16纯合突变10.52%(1/192)35delG纯合突变10.52%(1/192)SLC26A4 IVS7-2A>G纯合突变10.52%(1/192) IVS7-2A>G杂合突变10.52%(1/192)线粒体12Sr RNA12Sr RNA 1494C >T42.08%(4/192)12SrRNA1555A>G63.13%(6/192)GJB3538 C > T00

GJB2突变20例(10.42%，20/192)，本研究2例 SLC26A4 基因突变者均为3～5岁开始发作眩晕，均有2次以上突发性耳聋发作病史，经颞骨高分辨率 CT 扫描+三维重建见(见图1)，IVS7-2A>G纯合突变者CT显示双侧单纯前庭导水管扩大(见图1A)，不伴前庭及半规管异常。IVS7-2A>G杂合突变者CT显示双侧前庭导水管扩大与上、后半规管单脚汇合成的总脚相通(见图1B)，该例患者转诊外院行人工耳蜗植入术。

A：前庭导水管扩大，与总脚不相通；B：前庭导水管扩大，与总脚连通。 图1 2例SLC26A4突变颞骨高分辨率CT 扫描+三维重建

3 讨论

遗传性耳聋是临床上常见的缺陷性疾病，对人类的健康有较大的威胁，而遗传因素是其主要的致病因素。根据其临床症状可分为综合征性、非综合征性耳聋，在我国有4种主要的致病基因GJB2、GJB3、SLC26A4及mtDNA12SrRNA，涉及9个突变位点。GJB2是主要的一个引起遗传性耳聋的突变基因，它的突变会产生异常的连接蛋白Cx-26，从而影响细胞间隙连接，导致在内耳中的钾离子异常回收而致耳聋。SJC26A4基因主要编码蛋白质Pendrin，与氯/碘、氯/碳酸氢根等的转运有关，它的异常表达会导致Pendrin综合症以及大前庭水管综合症。GJB3是中国首个本土发现的耳聋基因，它的突变导致的耳聋临床表现为高频听力损失为主要特征的感音神经性耳聋，多为语后性耳聋。mtDNA12SrRNA主要引起DNA空间结构的改变而致聋，线粒体基因突变导致耳聋的遗传方式多为母系遗传，人类线粒体DNA突变、氨基苷类抗生素与耳聋的诱发密切相关，且致聋因素之间也存在相互关联。在由氨基苷类抗生素诱导的药物性聋患者中，mtDNA12SrRNA 1555A>G 和1494C >T 突变是主要的分子致病基础[5]。除红细胞外，人身体的其他细胞内均含有线粒体，但线粒体基因只能随女性的卵子遗传给下一代，即母系遗传[6]。

我们通过对192例耳聋学生进行了详细的病史调查、突变基因检测并通过分析其病史，基因突变检测显示192例聋哑学生中共检出32例基因突变阳性，检出率为16.67%，以GJB2基因235del C纯合突变最常见(13/20)；其次为线粒体12Sr RNA 1555A>G突变；发现2例SLC26A4；未发现GJB3基因突变。本研究与国内其它地区聋哑学校耳聋基因检测结果比较，耳聋基因检出率偏低，张怡[7]等报道黑龙江某聋哑学校103例耳聋患者共发现突变携带者47例，检出率为45.63%。张华[8]等采用飞行时间质谱检测河北省秦皇岛市聋哑学校耳聋患者基因突变四个基因的共20个位点，基因突变总的检出率为50%；可能与本研究耳聋基因检测位点少，血样采集、冻存及运输影响，我们未检测SLC26A4 基因H723R突变位点，所用检测方法需改进等有关。本组结果显示GJB2 235delC是遵义市汇川区特殊教育学校最常见的耳聋突变位点，占所有该基因全部突变检出位点的 40.63%(13/32)，因而GJB2 235delC应作为本地区主要筛查项目。

在中国人大前庭水管综合征患者中最常见的 SLC26A4 基因突变类型是IVS7-2A>G ，其次为H723R。我们对SLC26A4 基因的 IVS7-2A>G突变位点进行检测，2例发现突变，经颞骨高分辨率 CT+三维重建检查，2例均明确诊断为前庭导水管扩大。对耳聋学生及家长进行健康宣教，避免剧烈运动，防止跌倒伤及头部。线粒体mtDNA基因突变引起的遗传性耳聋较少见，具有母系遗传特性，因使用氨基苷类抗生素导致耳聋。mtDNA基因突变人群口服或静脉应用常用剂量或低于常用剂量就可诱发患者听力下降。本组汇川区特殊教育学校耳聋学生mtDNA的突变率为5.21%，1555A>G基因突变阳性率3.13%，高于全国平均水平2.86%。在前期的耳聋调查中，遵义市汇川区特殊教育学校有明确的氨基糖苷类应用后耳聋者31例，本组耳聋基因检测结果显示mtDNA基因突变检出率低，后续研究需扩大耳聋基因突变位点的检测及开展全基因组测序等，掌握本地区药物性耳聋基因突变谱，大力宣传耳毒性药物用药注意事项。

通过本课题研究，我们初步掌握遵义市汇川区特殊教育学校的遗传性耳聋患者发病情况、影响因素及基因突变情况。结合我院开展新生儿听力筛查10余年的经验及数据[9]，将对进一步深入开展耳聋研究，建立本地区耳聋家系数据库奠定基础。