基于ISSR标记的藤本月季品种遗传多样性及其分子身份证的构建

高鹏华 于文剑 赵芮 熊阳阳 王锦

摘要：38个藤本月季品种ISSR分子标记结果表明，23条引物共扩增出212个多态性位点，多态性比率高达72.35%。基因分化系数GS值变化范围在0.755～0.971，变化幅度较小，品种亲缘关系较近。38个藤本月季品种的群体遗传参数中平均观测等位基因数为1.973 5，平均有效等位基因数1.578 1，平均Neis基因多样性指数为0.372 6，平均Shannons信息指数为0.572 3。38个品种间的遗传分化系数（Gst）为0.785 6，基因流（Nm）为0.058 4，表明38个品种遗传多样性丰富。由聚类分析图可知，38个品种可聚为3个大类7个分支。以23条引物中多态性较好且能区分这38个供试品种的17条引物对不同品种扩增条带进行统计，建立了38个藤本月季品种的分子身份证。

关键词：藤本月季;ISSR标记;亲缘关系;遗传多样性;分子身份证

中图分类号： Q311;S685.120.36文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2019）18-0098-04

收稿日期：2018-05-08

基金项目：国家林业局“948”项目（编号：2014-4-19）;云南省高校林下生物资源保护及利用科技创新团队资助项目。

作者简介：高鹏华（1993—），女，河南濮阳人，硕士，研究方向为园林植物与观赏园艺。E-mail：786987934@qq.com。

通信作者：王 锦，博士，教授，研究方向为园林植物与观赏园艺。E-mail：908505685@qq.com。

藤本月季（climber，CL）是现代月季的一个重要支系，枝长，蔓性生长，花大，1季或4季开花[1]。因其攀援和观赏特性，藤本月季在观赏园艺中占有重要的地位。ISSR分子标记技术是一种简单、快速、高效的研究植物遗传多样性与亲缘关系的分子标记方法，已廣泛应用于狗牙根、红麻、油茶、大菊等植物的遗传多样性与分类鉴定研究。周俐宏等利用筛选出的11条ISSR引物对3种月季类型的23份月季材料进行遗传多样性分析，表明月季种质的遗传差异与其应用分类的相关性不紧密[2]。杨帆等利用ISSR分子标记结合形态学指标对17份蔷薇属植物进行亲缘关系研究，结果表明形态学聚类与ISSR聚类结果基本一致[3]。季春娟利用ISSR分子标记技术对17种蔷薇属植物进行遗传关系研究，表明17份供试材料遗传多样性较高[4]。刘燕运用ISSR和RAPD分子标记技术对13个观赏桃品种进行遗传多样性鉴定，结果表明与依据形态学分类结果较一致[5]。刘君等对9份狗牙根进行鉴定分析并建立了指纹图谱[6]。刘振等以ISSR、SSR、RAPD 3种分子标记方法对茶树进行分析，结果表明ISSR分子标记多态性较高[7]。郑海燕等以红麻为材料，运用ISSR和RAPD分子标记方法对其分子身份证进行构建[8]。因此，运用ISSR分子标记技术对藤本月季遗传多样性亲缘关系研究是可行的。

藤本月季品种资源丰富，品种间亲缘关系复杂，为品种的保护和利用带来一定的困难。我国自20世纪末引进藤本月季以来，对于藤本月季引种、快繁技术、生长特性及抗逆性的研究不断深入，但对其分子层面的研究尚处于空白状态。因此，本研究以38个藤本月季品种为材料，运用ISSR分子标记技术对其亲缘关系进行聚类分析，以期为藤本月季杂交育种和品种保护提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验所用的38个藤本月季材料来源于西南林业大学藤本月季资源圃及校园内绿化藤本月季品种，具体为Celme Forestier、The Wedgwood Rose、Handel、Abraham Darby、Glorie de Dijon、Souvenir du Doctor、Alchymist、Aloha、Eden Rose、Super Excelsa、Lady Hillingdon、Sir Paul Smith、Uetersen、Red Eden Rose、Bienvenue、Alfred Colomb、Phyllis Bide、Purple Skyliner、Giardina、Paul Transon、Pippin、Spirit of Freedom、Coral Dawn、Salammbo、Ginger Syllabub、Soleil Vertical、Granham Thomas、Papi Delbard、Clarence House、Moyesii Geranium、Cinderella、Blue Rambler、Parade、Hagoromo、Angela、Rosa multiflora f. carnea、R.multiflora var. platyphylla、R. multiflora var. cathayensis。

根据不列颠哥伦比亚大学公布的ISSR引物序列合成ISSR引物，通过筛选，最终确定23条ISSR引物用于供试样品扩增。

1.2 试验方法

1.2.1 DNA的提取 本试验采用Omega试剂盒对藤本月季总DNA进行提取，贮存于-20 ℃备用。

1.2.2 PCR扩增 引物由上海生物技术有限公司进行合成。23条引物为UBC 813、814、815、818、825、827、828、829、830、831、834、840、841、843、844、845、846、858、859、862、866、880、884。

PCR反应为20 μL体系：10×PCR Buffer 2 μL，DNA模板2 μL，上下游引物各1 μL，dNTP 1.5 μL，Taq酶1.5 μL，ddH2O 12 μL补足20 μL。PCR反应程序：94 ℃ 2 min;94 ℃ 30 s，Tm值30 s，72 ℃ 1 min，35个循环;72 ℃10 min。

1.5%琼脂糖凝胶检测，利用Quantity One软件分析电泳凝胶图，有条带记为“1”，无条带记为“0”，进行聚类分析，运用Popgene软件进行遗传多样性分析。

2 结果与分析

2.1 ISSR条带和多态性分析

23条ISSR引物对共扩增出293条带，其中多态性条带为212条，多态性比率为72.35%，每条引物扩增出5～11条多态性谱带，平均每条引物扩增出12.74条多态性条带。23条引物扩增出的条带在500～2 000 bp之间，不同引物在同一植物材料上扩增的条带数量和扩增片段大小不同，表明不同引物与模板DNA的结合位点不同，同一引物在不同品种间的扩增条带也不同，如在用引物UBC 866对这38个品种进行扩增时，Blue Rambler存在条带的特异性缺失，Angela的特异性扩增等（图1）。23条ISSR引物的平均多态性比率为73.7%，多态性比率位于56%～92%。这些都反映了藤本月季品种间的多态性差异。对比23条ISSR引物，其中20条为二核苷酸重复序列，2条三核苷酸重复序列，1条为五核苷酸重复序列，表明38份供试材料中二核苷酸重复序列多。

2.2 ISSR聚类分析与遗传多样性分析

利用Popgene 1.32软件计算出38个不同品种之间的Neis基因多样性指数（H）以及Shannons信息指数（I）。结果表明，38个藤本月季品种的平均Neis基因多样性指数为0270 5，平均Shannons信息指数为0.406 9。38个品种间的遗传分化系数（Gst）为0.785 6，基因流（Nm）为0.136 4。遗传分化系数可以说明总遗传变异78.56%来自品种间。由此可知，38个藤本月季品种间的遗传分化水平较高，而基因交流频率较低。

由图2可知，38个供试材料共可分为3个大类7个较大分支。Salammbo与Angela、Bienvenue、Soleil Vertical、Souvenir du Doctor、Sir Paul Smith、Alfred Colomb、Abraham Darby、Clarence House、Ginger Syllabub、Eden Rose、Red Eden Rose 12个品种聚为一类，其中Red Eden Rose与其他品种的遗传距离最远单独成为一支，Soleil Vertical、Alfred Colomb、Abraham Darby、Bienvenue 4个品种的亲缘关系较其他品种近聚为一小支;Parade、Glorie de Dijon、Lady Hillingdon、Uetersen、R. multiflora f. carnea、Spirit of Freedom同Coral Dawn 7个品种被分为一大支，根据相对遗传距离远近，Glorie de Dijon被分在最外面一支，Parade与Lady Hillingdon、R.multiflora f.carnea均被单独分出，剩下2个品种成为一小支;剩余19个品种被聚为一类，在这19个品种中Hagoromo与其他18个品种相对距离较远单独成为一支，Granham Thomas与Celme Forestier聚在一起成为一支，Moyesii Geranium、Paul Transon、Papi Delbard、Giardina、Aloha、Cinderella与Pippin 7个品种被聚为较一大支，Pippin与Papi Delbard被聚在一起，Handel与R. multiflora var. platyphylla相对遗传距离较近被聚在一起，Purple Skyliner与R. multiflora var. cathayensis单独聚在一起。

2.3 分子身份证的建立

以23条引物中多态性好，且能区分38个藤本月季的17条引物建立分子身份证，其中有条带记为“1”，无条带记为“0”。

3 讨论与结论

自PCR技术发明以来，运用PCR技术对动植物的遗传多样性进行分析已经成为最主要的一门技术。运用ISSR分子标记技术对植物的遗传多样性进行分析对样本的DNA浓度要求不高，而且操作简单，价格低廉，试验结果的可重复性高，结果稳定。赵凯歌在对腊梅属种质资源进行ISSR鉴定时发现，ISSR重复性高达99.08%[9]。本试验同样获得了较高的重复性。在运用分子标记对植物的亲缘关系进行分析方面，前人的研究都取得了一定的成果。本试验以38个藤本月季品种为材料，研究表明38份材料根据ISSR分子标记多态性分类结果与其形态学观赏特性分类存在一定的差异，如在遗传相似系数为0.947时，可将Soleil Vertical与Souvenir du Doctor，Sir Paul Smith与Alfred Colomb分别分为2组，但Soleil Vertical的花为深黄色，半重瓣，Souvenir du Doctor的花酒红色，半重瓣。因此，本试验的研究结果与夏至等对蔷薇科植物的研究结果即蔷薇属植物的遗传多样性较高[10]一致。同时本试验结果表明，在对藤本月季分类时不能简单地依靠其形态学表现进行分类。

对所筛选出的多态性较高的引物分析表明，二核苷酸重复序列较多，其中A、C或A、G及C、T組合的多态性较高，这与杨帆利用ISSR对17份蔷薇属植物亲缘关系的研究中发现富含AC、AG组合的二核苷酸重复序列多态性较高结果[3]一致。表明在对蔷薇属特别是月季品种之间亲缘关系鉴定选用富含AG、AC或AT组合的引物是可取的。

通过对38个藤本月季品种的遗传多性的分析及分子身份证的构建，可以为今后藤本月季的遗传育种及其开花机理，花色、花型等方面进行深入研究提供一定的基础数据。同时，对藤本月季的新品种的鉴定和保护提供理论方法的借鉴，可以更加快速地对未知品种进行认定。

参考文献：

[1]朱秀珍，张佐双. 中国月季[M]. 北京：中国林业出版社，2006：1-4.

[2]周俐宏，张金柱，李 振，等. 利用ISSR揭示不同类型月季遗传多样性[J]. 基因组学与应用生物学，2009，28（2）：311-315.

[3]杨 帆，曾 丽，叶 康，等. 17份蔷薇属植物的亲缘关系的形态学和ISSR分析[J]. 植物研究，2011（2）：193-198.

[4]季春娟. 部分蔷薇属种质资源亲缘关系ISSR分析及‘平阴玫瑰的适应性种植[D]. 上海：上海交通大学，2010.

[5]刘 燕. 利用RAPD和ISSR技术对13个观赏桃品种的遗传多样性分析[D]. 雅安：四川农业大学，2011.

[6]刘 君，赵 琴，杨志民. ISSR分子标记对9种狗牙根的鉴定分析[J]. 草业学报，2012，21（6）：159-165.

[7]刘 振，赵 洋，杨培迪，等. SSR、SRAP、ISSR分子标记在茶树品种亲本鉴定上的比较分析[J]. 茶叶科学，2014（6）：617-624.

[8]郑海燕，粟建光，戴志刚，等. 利用ISSR和RAPD标记构建红麻种质资源分子身份证[J]. 中国农业科学，2010（17）：3499-3510.

[9]赵凯歌. 用形态标记和分子标记研究蜡梅栽培种质的遗传多样性[D]. 武汉：华中农业大学，2007.

[10]夏 至，周 艳，王璐静，等. 月季花、玫瑰及其近缘种ISSR分析与鉴定[J]. 中草药，2016，47（24）：4433-4438.