隐球菌脑膜炎患者脑脊液宏基因组二代测序结果分析

葛 瑛，范思远，陈健华，申 奥，窦洪涛，肖 盟，徐英春，宫燕萍， 任海涛，吴红龙，关鸿志

中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院 1感染内科 2神经科 4检验科， 北京 1007303天津华大医学检验所， 天津 300308

隐球菌广泛存在于自然界的土壤及鸽粪等鸟类排泄物中，属条件致病菌，常累及肺、皮肤、中枢神经系统。隐球菌有两种主要血清型，新型隐球菌和格特隐球菌[1]，在中国新型隐球菌最常见[2]。隐球菌脑膜炎主要见于免疫功能低下人群，尤其是人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)感染者，也可发生于HIV阴性的器官移植或应用激素免疫抑制剂治疗的患者。全球每年新发隐球菌脑膜炎超过100万例，死亡约60万例/年[3]。近年有文献报道免疫功能正常人群也可发生隐球菌脑膜炎[4]，一旦感染，死亡率接近20%[5]。因此，早诊早治对改善患者预后至关重要。

由于临床表现及脑脊液检查结果缺乏特异性，目前对隐球菌脑膜炎，尤其是免疫功能正常患者的早期诊断，还存在相当比例的漏诊和误诊[6]。分子生物学检测是近年兴起的一种病原学检测方法，可以提高传统检测方法的检出率，关于脑脊液宏基因组测序用于临床微生物检测的研究报道逐渐增多[7- 11]。本文分析了脑脊液宏基因组二代测序(metagenomic next-generation sequencing，mNGS)技术用于隐球菌脑膜炎诊断的病例，探讨该技术对临床诊断的潜在价值。

1 资料与方法

1.1 研究对象

回顾性收集北京协和医院神经科牵头组织的脑炎多中心临床登记研究数据库中，2014年1月至2016年12月期间采用mNGS技术诊断的隐球菌脑膜炎患者临床资料。

纳入标准：(1)临床存在脑炎或脑膜炎症状及体征；(2)脑脊液常规、生化检查异常，提示颅内感染；(3)脑脊液mNGS 检测出隐球菌，同时排除穿刺损伤引起的血液污染；(4)患者临床特点、辅助检查支持隐球菌脑膜炎，且抗真菌治疗的效果与转归均符合mNGS诊断。需同时满足上述4条标准。

本研究获得中国医学科学院北京协和医院伦理委员会批准(伦理批号：JS- 890)。所有患者或家属签署知情同意书。

1.2 临床资料收集

收集患者主要临床表现、颅内压、脑脊液常规检测、生化检查、头颅磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)检查以及脑脊液涂片、墨汁染色、隐球菌抗原检测等相关临床资料。

1.3 宏基因组二代测序

在常规腰椎穿刺检查时额外留取1 ml脑脊液，采集后立即-20 ℃冻存，保存在干冰中运输至天津华大医学检验所进行病原菌mNGS分析。

取300 μl脑脊液样本，采用TIANampMicroDNA试剂盒[天根生化科技(北京)有限公司]提取DNA。提取的DNA经超声破碎至150～200 bp核酸，经末端修复、接头连接、PCR扩增等步骤制备DNA文库。使用安捷伦2100生物分析仪(加拿大安捷伦科技公司)质控，使用QPCR定量文库浓度。质控合格的DNA文库在BGISEQ- 100测序平台(深圳华大集团)测序[12]。

获取原始测序数据后，过滤低质量和长度<35 bp的序列，应用BWA软件(http：//bio-bwa.sourceforge.net)比对人的参考序列，去除人源序列后，将剩余序列与微生物数据库(包括细菌库、真菌库、病毒库及寄生虫库)进行比对，实现对微生物的注释并自动输出检测报告。

1.4 PCR鉴定

利用Primier软件设计引物，新型隐球菌和格特隐球菌的上下游引物分别为CRG- 5F ACGATTGTGTC ACGTCGAGC和CRG- 5R TGCAGGTTTCCACCCTTTCC。对隐球菌特异片段进行扩增，随后采用ABI3730xL型基因分析仪(美国赛默飞)测序，利用NCBI中BLAST数据库分析测序序列。由于标本量的限制，仅对3例样本进行验证。

1.5 菌种鉴定

对mNGS分析提示格特隐球菌感染的样本，采用电离飞行质谱分析仪(MALDI-TOF MS，德国布鲁克)同时对rDNA内转录间隔区域(internal transcri-bed spacer，ITS)进行测序、鉴定、确证[13]。

1.6 常规脑脊液真菌培养

取脑脊液标本1～5 ml注入BDFX400需氧培养瓶(美国BD公司)，仪器自动报警后分区划线接种于沙氏培养基，分别置于35 ℃和25 ℃孵育箱中培养12～24 h，用YST 酵母菌生化鉴定卡对其进行菌种鉴定。

1.7 脑脊液墨汁染色

将脑脊液高速离心，弃上清，沉淀以5∶1比例与墨汁混匀镜检；或采用自然沉淀法，用侯氏脑脊液细胞学沉淀器制片，滴加1∶1稀释的墨汁，加盖玻片镜检。黑色背景下见到出芽或大小不均的菌体及透亮荚膜即可判断为墨汁染色阳性。

2 结果

2.1 一般临床资料

6例符合入选和排除标准的患者均来自中国北方地区，男性4例，女性2例，年龄26～53岁，中位年龄51岁。所有患者既往体健，HIV阴性，亚急性病程，最常见的临床症状包括头痛、发热、恶心、呕吐。2例患者出现复视，1例出现一过性意识丧失。

2.2 头颅磁共振成像

6例患者均接受头颅MRI检查，其中1例在发病2个月后显示双侧基底节区多发囊性病变(图1A、1B)，发病12个月暨抗真菌治疗11个月时，病变范围扩大(图1C、1D)，继续抗真菌治疗8个月后颅内病灶缩小(图1E、1F)。其余5例患者头颅MRI无异常表现。

图 1 隐球菌脑膜炎患者的头颅磁共振成像 左列为T1加权像，右列为T2加权像; A、B.发病2个月时，双侧基底节区显示多发囊性病变；C、D.发病12个月、治疗11个月后，双侧基底节区多发囊性病灶范围扩大；E、F.抗真菌治疗8个月后，双侧基底节区多发囊性病灶缩小

2.3 脑脊液常规检查

6例患者出现不同程度的颅内压升高及脑脊液细胞数增多，脑脊液中蛋白含量轻度升高，糖正常或轻度降低(表1)。5例患者脑脊液墨汁染色阳性(患者1～4和6，图2)，4例隐球菌抗原检测阳性(患者1～3和5)，2例真菌培养阳性。

2.4 疗效观察

抗真菌治疗后，6例患者临床症状改善，主要治疗方案包括两性霉素B 0.5～0.7 mg/(kg·d)联合氟胞嘧啶100 mg/(kg·d)，序贯氟康唑400 mg/d单药治疗。

2.5 脑脊液二代测序及PCR验证结果

6例患者的脑脊液标本均进行了新型隐球菌及格特隐球菌的测序、鉴定(表1)。排除背景菌序列后，NGS检测到所有隐球菌的核酸序列数为108～25 361，基因覆盖率为0.19%～29.00%，检测深度为1。其中患者2～6的新型隐球菌序列数明显高于格特隐球菌，而患者1的格特隐球菌序列数则显著高于新型隐球菌(图3，4)。检测结果显示存在背景菌，包括痤疮丙酸杆菌、根瘤菌属、酸热脂环酸杆菌等。

患者1、2、4经PCR检测证实为隐球菌感染(图5)，患者1经飞行质谱分析仪鉴定验证为格特隐球菌感染。验证结果均符合mNGS的分析结果。

表 1 6例隐球菌脑膜炎患者脑脊液实验和mNGS检测结果

mNGS：宏基因组二代测序；C-Ag：隐球菌抗原

图 2 脑脊液墨汁染色可见大量隐球菌(自然沉淀法侯氏沉淀器制片，×200)

3 讨论

本研究对临床拟诊隐球菌脑膜炎的患者同时进行传统涂片、染色、培养、血清学检测和mNGS的方法检测，结果显示，传统脑脊液培养的阳性率较低，血清学检查、墨汁染色及宏基因组mNGS的检出率较高，且mNGS可检出格特隐球菌血清型菌，弥补了传统方法无法进行菌种鉴定的不足。

隐球菌为机会性致病菌，多见于免疫缺陷尤其是艾滋病患者，免疫功能正常患者的隐球菌脑膜炎常出现漏诊或误诊。隐球菌脑膜炎的临床表现缺乏特异性，部分患者并无明确的鸽子、鸟类接触史，由于中国大部分地区结核患者相对多见，其脑脊液变化与隐球菌脑膜炎接近，故常误诊为结核性脑膜炎而延误治疗。因此，隐球菌脑膜炎早期确诊和针对性治疗至关重要。

图 3格特隐球菌序列数高的隐球菌脑膜炎患者脑脊液宏基因二代测序检测结果

A.核酸序列在格特隐球菌基因组的位置； B.序列分布图

图 4新型隐球菌序列数高的隐球菌脑膜炎患者脑脊液宏基因二代测序检测结果

A.核酸序列在新型隐球菌基因组的位置； B.序列分布图

图 5 隐球菌脑膜炎患者脑脊液PCR验证结果A.患者1(泳道064)和患者2(泳道219- 2)，N为空白对照， M为Trans2K DNA Marker； B.患者4(泳道434)，N为空白对照，M为DL2000 DNA Marker

传统真菌培养将脑脊液置于沙堡培养基进行孵育，通常需3～14 d，且不同实验室的敏感度差异很大，本研究中仅2例脑脊液培养阳性。近年隐球菌抗原侧流式免疫层析法(CrAgLFA)和乳胶凝集或酶免疫测定法逐渐成为主要检测方法，但这些方法无法鉴别潜伏感染和现症活动感染[14]，且不同试剂盒间的差异显著。

本研究尝试采用mNGS技术辅助隐球菌脑膜炎诊断，具备以下优势：(1)mNGS技术检测速度较快，目前可在48 h内得到结果，尽早诊断意味着患者有可能获得更好的预后；(2)测序结果可提示患者存在现症感染，对临床医生选择治疗方案具有重要意义；(3)由于mNGS是基于从无知到已知的筛查过程，常可在临床表现不典型或缺乏相应表现时提供有意义的诊断信息，如本研究中患者6就是在延误诊断3个月后才通过mNGS确诊；(4)mNGS可有效区分新型隐球菌和格特隐球菌，在中国，新型隐球菌及格鲁比变种最常见，是国内引起隐球菌脑膜炎的主要病原菌[2,15- 16]，格特隐球菌具有明显的地域分布特点，热带地区多见，而在中国罕见，尤其是北方地区[17- 18]。由于我国流行病学数据显示以新型隐球菌感染为主，故临床一旦发现隐球菌感染的证据，均常规按新型隐球菌进行治疗。其实格特隐球菌与新型隐球菌感染在疾病进展及治疗策略方面存在显著差异，在HIV阴性患者中格特隐球菌出现神经系统并发症的比例较高，如脑组织多发性肉芽肿性损伤，对抗真菌药物的反应差，需进行神经外科手术干预的比例显著高于新型隐球菌[1,19]。而目前通过常规微生物组织学和生化鉴定方法，包括墨汁染色、常规培养以及隐球菌抗原检测等方式均无法对二者进行鉴别。本研究的6例患者中，5例为新型隐球菌感染，1例为格特隐球菌感染，所有患者来自北方地区，提示我国北方地区格特隐球菌感染情况值得关注。

5例新型隐球菌脑膜炎患者的头颅MRI未见异常，而格特隐球菌感染的1例患者则出现双侧基底节病变，与文献报道相符[20]。本研究提示，mNGS联合脑脊液生化检测可有效鉴别上述两个不同菌种，随着格特隐球菌病例数的积累，其临床特点或许会逐渐清晰准确。

由于本研究为单中心数据，病例数少，仅对部分病例进行了脑脊液PCR验证，可能会对分析结果有一定影响。

脑脊液mNGS技术可准确判断隐球菌感染，并对鉴别格特隐球菌具有一定优势，有助于降低免疫功能正常人群隐球菌脑膜炎的漏诊情况。病原体mNGS技术正处于快速临床转化阶段，需要更多的研究和数据支持。结果判读亦需临床医师密切结合患者病情综合判断，这是目前存在的普遍问题，需进一步统一规范。虽然脑脊液mNGS技术快速精准，但需结合成本费用、适用的疑难/复杂病例选择等问题综合考虑。