饲粮NDF/NFC 对泌乳后期奶牛瘤胃甲烷排放量、营养物质表观消化率及生产性能的影响

王 贝，许贵善，李斌昌，董利锋，王睿鑫，刁其玉*

（1.中国农业科学院饲料研究所，农业部饲料生物技术重点实验室，奶牛营养学北京市重点实验室，反刍动物及其幼畜营养代谢中美联合研究中心，北京 100081；2.塔里木大学动物科学学院，新疆阿拉尔 843300；3.甘肃农业大学动物科学学院，甘肃兰州 730070）

反刍动物瘤胃产甲烷主要是产甲烷菌将二氧化碳和氢气合成甲烷的一种自然生理过程，同时属于可以人为调控的发酵过程。据联合国粮农组织报道，反刍动物以甲烷能形式损失的能量占摄入总能的2%～10%，而瘤胃发酵产生的甲烷占总产量的95%以上。Knapp 等[1]认为，减少甲烷能损失可以减少摄入总能损失，提高动物的生产性能。Jiao 等[2]发现，增加精料水平可显著降低单位干物质甲烷排放。因此建立科学合理的减排技术是关键，而营养性调控是所有抑制技术的基础。目前关于反刍动物甲烷排放的研究大多为实验室或呼吸测热室测定数据，虽然呼吸测热室法测定结果准确，但是在反刍动物非自然状态下。也有较多学者建立估算模式，易获得甲烷产量，但与实际有一定差距[3-6]。六氟化硫（SF6）示踪技术的最大特点就是可在生产条件下直接测定动物甲烷排放量[3,7-8]。目前国内尚缺乏使用SF6示踪法测定不同泌乳阶段奶牛甲烷排放量的研究，在仪器测试方面，由于气相色谱仪器内预柱和色谱柱的差异，色谱柱内填充物以及色谱柱长度的差异，决定了测试结果的差异。且联合国政府间气候变化专门委员会（Intergovernmental Panel on Climate Change，IPCC）测算方法易高估我国反刍动物甲烷排放量。饲粮精粗比只能粗略而不能准确表示饲粮中易发酵碳水化合物的真正含量和营养物质之间相互平衡，因为粗料和精料各自都包括可发酵碳水化合物和纤维物质，只是比例和含量不同。而中性洗涤纤维（NDF）和非纤维性碳水化合物（NFC）则能较为客观全面体现饲粮中纤维物质和易发酵碳水化合物的含量。NDF/NFC 能够更真实地反映饲粮中纤维物质和易发酵碳水化合物的比例[9]。本试验在奶牛生产条件下，采用SF6示踪法测定不同NDF/NFC饲粮下瘤胃发酵甲烷产量，旨在研究奶牛甲烷排放规律，为减少奶牛瘤胃发酵能量损失和绿色营养调控技术提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验设计及饲粮 试验选用体重（777.46±27.31）kg、胎次（1.5±0.15）胎、泌乳天数（242.92±15.28）d、产奶量（18.75±0.62）kg/d 的12 头健康荷斯坦泌乳期奶牛，采用随机区组设计分为3 组，即NDF/NFC 分别为1.52（低组）、1.96（中组）、2.10（高组），每组4 头牛。各组饲粮组成及营养成分见表1，其中高NDF/NFC 组为试验牧场饲喂经典饲粮。

试验于2018 年5 月6 日在北京市房山区琉璃河镇赵营村某奶牛场进行。试验开始前，各组试验奶牛的平均日产奶无显著差异。饲养试验进行23 d，包括14 d预试期，于正试期的前5 d 测定肠道甲烷排放速率，每天08:30 至次日08:30 为气体采集期的1 d，在正试期第6～8 天进行消化代谢试验，并采集每头奶牛乳样以备测定乳成分，在正试期结束的最后1 天，在晨饲3 h 后通过瘤胃液采样器进行瘤胃液样品的采集。

1.2 饲养管理 各试验组分群饲喂，统一管理，于每天06:00 和18:00 饲喂全混合饲粮（TMR）各1 次，每天05:00 和17:00 采用管道式挤奶机挤奶。3 个处理组试验牛均自由采食，自由饮水。试验期内平均全天最高温度28.2℃，最低温度17.4℃，平均温度22.8℃；最高湿度72%，最低湿度39%，平均湿度56%。圈舍每周消毒1 次，所有参试奶牛的饲养环境、饲喂方式、饲粮和饲喂程序均保持一致。

表1 试验饲粮组成及营养成分（干物质基础） %

1.3 样品采集与分析

1.3.1 SF6示踪技术 在预试期最后3 天采用投药枪将SF6渗透管成功投入待测奶牛瘤胃中，在正试期的前5 d 测定胃肠道甲烷排放速率，连续收集气体样品24 h（08:30至次日08:30），并将气样于3 d 内带回实验室使用气相色谱仪进行测定。该技术主要包括渗透管的制备、渗透管渗透速率的测定以及采用气相色谱仪测定甲烷的排放量。

①将黄铜材质的渗透管打开，依次将支持垫、渗透膜、密封圈装入螺帽中，按压平整紧实，将编号对应的螺帽和管体用扳手拧紧，组装成完整渗透管后，放在精确度为0.000 1 g 的分析天平（ME104E/02，梅特勒-托利多仪器有限公司，上海）上称重，并记录。

②将整个渗透管完全浸入液氮中，待管体温度完全降至 -196℃，用钳子取出渗透管，用注射器吸取高纯SF6气体（纯度为99.999%，北京海普气体有限公司，北京）300 mL 迅速注入渗透管中，并迅速拧紧螺帽，静置，待渗透管温度升至室温时用扳手再拧紧1 次后称重，并记录。

③将制备好的渗透管放入提前预热好的生化培养箱（Blabotery SPL-80，天津市莱玻特瑞仪器设备有限公司，天津）中进行39℃恒温厌氧培养，以40 mL/min的流量（玻璃转子流量计，LBZ-3WB，泰州俊海仪表有限公司，江苏）通入氮气，以模拟瘤胃环境，每间隔5 d 对渗透管称重1 次，并记录日期和时间。待渗透速率稳定后，对稳定后数据进行线性回归分析，自变量x为培养时间，因变量y 为渗透管重，回归方程的斜率为SF6渗透速率，取决定系数大于0.99 的渗透管待用。

④选取渗透速率稳定，释放时间较长的渗透管，使用投药枪投入待测动物瘤胃中，待渗透速率稳定（3 d）后，于每天清晨饲喂前开始采样，每次采样时间为连续24 h，并在牛舍周围选取合适位置对背景气体进行采集。采样管路使用定制龙头固定于奶牛口鼻上方，集气瓶使用专用背垫固定于奶牛脊背。

⑤集气瓶在使用前检漏，采样前将集气瓶用高纯氮气（纯度为99.999%，北京利合成泰气体有限公司，北京）冲洗3 次后，使用真空泵（2ZX 型旋片式真空泵，浙江台州求精真空泵有限公司，浙江）抽至负压（约-98 kPa），采气后集气瓶的剩余压力在-40 kPa 以上表明采样成功。测定时将高纯氮气充入集气瓶使其为正压（约120 kPa）。

⑥采用气相色谱仪（上分GC-126，上海仪电分析仪器有限公司，上海）测定气体样品。GC-126 为二维色谱双检测器联用，可一次进样同时收集2 套数据进行定性和定量分析，分别采用氢火焰离子检测器（FID）和电子捕获检测器（ECD）测定样品和背景气体中甲烷和SF6含量，通过以下公式计算泌乳奶牛甲烷产量：

其中，CH4为泌乳奶牛甲烷排放量；SF6（mg/d）为渗透管的渗透速率；CH4（样品）和CH4（背景）分别为泌乳奶牛样品和背景中的甲烷浓度，单位为ppm（1 ppm CH4=7.14×10-4g/m3CH4）；SF6（样品）和SF6（背景）分别为泌乳奶牛样品和背景中的气体浓度，单位为ppt（1 ppt SF6=6.518×10-9g/m3SF6）；16.04 和146.06 分别是CH4和SF6的分子量。

气相色谱仪器准备和测定条件：气相色谱仪配备FID 和ECD 检测器，可一次进样同时测定CH4和SF6；载气为高纯氮气，流量40 mL/min；燃气为高纯氢气，流量为30 mL/min；助燃气为干燥压缩空气；色谱柱温40℃；进样口温度150.0℃；FID 检测器温度150.0 ℃；ECD 检测器温度300.0 ℃；SF6标 准 气（标准气体，北京海普气体有限公司，北京）浓度为6.518×10-8g/m3（即0.01 ppb）SF6和7.14×10-3g/m3（即10 ppm）CH4，填充气为高纯氮气，SF6采用单点校正法进行标定；将气体样品经过装有定量阀的进样器进样，重复进样3 次以上，峰面积偏差小于5%时取平均值作为有效峰面积，套入标准曲线取对应浓度值。

1.3.2 消化代谢试验

1.3.2.1 营养物质消化率 采用酸不溶灰分法（AIA 法）测定。在试验正试期记录每天投料量，剩料量控制在5%～10%，计算干物质采食量（DMI）。在正试期采集粪样的同时收集对应TMR 饲料样，将各处理组饲料分别混合均匀后四分法缩样，各取500 g，密封于自封袋中-20℃冷冻保存待测。每天09:00 和19:00 直肠采集粪样2 次，每次200 g，粪样连续收集3 d；采集的鲜样每100 g 加10 mL 10% 盐酸固氮，混匀后密封于自封袋中-20℃冷冻保存待测。将TMR 样和粪样带回实验室后65℃烘48 h，回潮24 h 后称重，粉碎过40 目筛制成分析样品后，密封于自封袋中，-20℃冷冻保存待测。

TMR 样和粪样中常规营养成分的测定方法：总能（GE）使用Parr-6400 全自动氧弹量热仪（北京东方圣隆达科技有限公司，美国）测定；粗蛋白质（CP）含量使用KjeltecTM Sampler 8420 全自动凯氏定氮仪（FOSS，苏州安创仪器有限公司，丹麦）测定；粗脂肪（EE）含量使用ANKOMXT15 全自动脂肪仪（南京瑶恩仪器设备有限公司，美国）测定；干物质（DM）、中性洗涤纤维（NDF）、酸性洗涤纤维（ADF）、粗灰分（Ash）含量指标参照《饲料分析及饲料质量检测技术》测定[10]，有机物（OM，%）=1－ Ash；同时测定酸不溶灰分（AIA）含量，用于营养物质表观消化率的计算。

饲粮表观消化率采用内源指示剂酸不溶灰分（4 mol/L盐酸不溶灰分）法测定，计算方法参照Zhong 等[11]的公式：

1.3.2.2 产奶量及乳成分 试验开始前7 d 准确记录试验奶牛初始产奶量，正试期每天记录每头奶牛产奶量。计算试验期间的平均日产奶量、平均乳成分含量。在正试期结束前连续3 d 按照早晚1:1 的比例取奶样，取样量为每天50 mL，奶样添加万分之六重铬酸钾用作防腐剂，4℃保存待测待奶样采集完毕后及时送至北京奶牛中心乳品质量检验站进行检测。产奶净能（NEL）和奶牛能量单位通过以下公式计算：

其中，OM 为有机物，M 为乳脂率为F 的牛奶量（kg）；F 为牛奶的实际乳脂率（%）。

1.4 统计分析 试验数据采用Excel 2016 进行初步整理后，采用SPSS 20.0 软件One-Way ANOVA 模型进行单因素方差分析和方差齐性检验，差异显著时用Duncan´s法进行各组间多重比较，P＜0.05 为差异显著，P＜0.01 为差异极显著，0.05＜P＜0.10 为存在差异趋势。

2 结果与分析

2.1 饲粮NDF/NFC 对泌乳后期奶牛瘤胃甲烷排放量的影响 由表2 可见，采用气相色谱法测定试验牛瘤胃甲烷排放量，不同NDF/NFC 饲粮对泌乳后期奶牛瘤胃甲烷排放量的影响达显著水平；单位代谢体重的甲烷产量随着NDF/NFC 的降低而表现出下降趋势（0.05＜P＜0.10）；单位DMI、单位有机物采食量（OMI）的甲烷排放量均随着试验饲粮NDF/NFC 的降低而显著降低，低、中、高 3 组之间差异显著，其中低组最低，高组最高。单位NDF 采食量（NDFI）和ADF 采食量（ADFI）甲烷产量在3 组间差异不显著。单位总能摄入量（GEI）的甲烷能在3 组间存在显著差异。低组单位产奶净能的甲烷能产量显著低于高组，中组与低组和高组相比差异均不显著。单位消化能的甲烷能产量在3组间存在极显著差异。单位代谢能的甲烷能产量在3 组间没有显著差异。

单位日产奶量的甲烷产量在3 组间差异显著，但单位FCM 的甲烷排放量差异不显著。单位ADF 采食量甲烷产量均随着试验饲粮NDF/NFC 的降低而显著降低。单位NDF 采食量甲烷产量在3 组间差异不显著。

表2 饲粮NDF/NFC 对泌乳后期奶牛瘤胃甲烷排放量的影响

2.2 饲粮NDF/NFC 对泌乳后期奶牛营养物质表观消化率的影响 从表3 可以看出，3 组间DM、GE、CP 等的表观消化率差异不显著，但各组在数值上表现为随着NDF/NFC 降低，各营养物质表观消化率逐渐升高。其中EE 的表观消化率在各试验组间差异显著，低组和中组较高组分别提高了20.86%和4.35%。

2.3 饲粮NDF/NFC 对泌乳后期奶牛生产性能和饲料转化率的影响 由表4 可见，试验牛试验前体重和产奶量差异不显著，低组和中组较高组相比有增加趋势。在试验期内，中组较高组的平均产奶量、FCM 较高组分别提高了9.41%和26.87%；低组较高组平均产奶量降低了0.63%，但FCM 较高组提高了1.02%（P＜0.05）。单位总能摄入量的FCM 在数值上中组最高，较高组提高了19.93%；低组和高组相当；3 组间无显著差异。试验期前后低、中、高 3 组产奶量分别降低了0.94、0.44、1.08 kg/d。中组的饲料转化率较低组提高了19.39%，3组间差异不显著。

3 讨 论

3.1 饲粮NDF/NFC 对泌乳后期奶牛瘤胃甲烷排放量的影响 瘤胃厌氧发酵产生的甲烷是瘤胃微生物将饲料中纤维素和碳水化合物转化为挥发性脂肪酸过程中的必然产物。甲烷的产生在维持正常的瘤胃发酵过程的同时也耗损大量能量。研究表明，反刍动物的甲烷排放量的主要受饲料组合类型、饲料营养水平、采食量、环境温度和食糜外流速度等因素的影响。不同NDF/NFC 饲粮通过影响瘤胃内挥发性脂肪酸产量和乙酸丙酸比值，改变甲烷菌合成甲烷所需氢气的量，最终影响甲烷排放量。饲粮精料比例增加能够使瘤胃发酵模式由乙酸发酵型趋向于丙酸型发酵，使乙酸丙酸比值降低，同时降低甲烷菌合成甲烷的底物氢气的浓度，最终降低甲烷排放量；同时精料比例增加可以改变瘤胃优势菌群结构，抑制瘤胃原虫的活性，因甲烷菌和原虫存在共生关系，从而降低甲烷的生成[3-6]。娜仁花等[14]研究发现，精粗比为60:40 的饲粮甲烷排放量显著低于精粗比为40:60 的饲粮。Aguerre 等[15]研究表明，随着精料水平升高，瘤胃甲烷产量降低；NDF 发酵量越大，甲烷排放量越大。崔安等[16]研究发现，提高秦川肉牛的饲粮精粗比可显著降低甲烷排放量。Moss 等[17]和Chandramoni 等[18]研究发现，随着饲粮NDF/NFC 升高，甲烷排放量逐渐升高。本试验中，低组（NDF/NFC 为1.52）、中组（NDF/NFC 为1.96）、高组（NDF/NFC 为2.10）试验奶牛单头的甲烷排放量分别为241.83、329.33、395.61 g/d，表明泌乳后期奶牛瘤胃甲烷排放量随着饲粮NDF/NFC的增加而显著降低，与上述研究结果相一致。

表3 饲粮NDF/NFC 对泌乳后期奶牛营养物质表观消化率的影响 %

表4 饲粮NDF/NFC 对泌乳后期奶牛生产性能的影响

本试验中，低、中、高 3 组的单位DMI 的甲烷产量分别为15.69、20.60、26.18 g/kg，与丁静美等[19]、周艳等[20]的结果一致。分析其原因可能是由于低精料饲粮NDF 和ADF 含量含量较高，单位采食量内摄入量较大，使瘤胃内发酵产生乙酸量增加，乙酸型发酵成为优势发酵模式，纤维分解菌、甲烷菌活性增大，甲烷排放量增加。而高精料饲粮有利于瘤胃生产较高浓度丙酸，丙酸可与甲烷菌竞争氢气合成葡萄糖，从而减少了甲烷产量。另外，高采食量增大了瘤胃食糜的流通速率，减少了发酵底物与瘤胃微生物的接触范围和作用时间，改变了瘤胃发酵模式，从而减少甲烷排放量[1,21]。采食量的升高增加了生成甲烷的底物供应量，纤维物质在瘤胃内得到充分发酵，发酵模式趋向于乙酸发酵，有利于增加纤维分解菌和甲烷菌的活性，导致甲烷产量较高[22-23]。

吴爽等[24]研究发现，在精粗比同为40:60，以不同粗饲料及其组合的4 种类型饲粮饲粮饲喂干奶牛，结果显示4 种饲粮的单位GEI 的甲烷能在4.7%～5.5%。本试验中，NDF/NFC 为1.52 的饲粮单位GEI 的甲烷能为5.06%，与前人的研究结果一致。本试验中饲粮NDF/NFC 从1.52 提高到2.10，3 种饲粮的单位GEI 的甲烷能为5.06%～9.17%。娜仁花等[14]的结果显示，精粗比为 40:60 的玉米秸秆型饲粮、精粗比为40:60和 60:40 的玉米秸秆青贮型饲粮的单位GEI 的甲烷能为5.91%～7.13%，3 组饲粮的NDF 及ADF 含量分别为61.80%、61.58%、57.44% 及34.22%、29.56%、22.96%。本试验中NDF/NFC 为1.52、1.96 和2.10，3种饲粮的NDF 及ADF 含量分别为42.07%、46.73%、49.11%及13.09%、14.46%、16.10%。饲料精料比例增加，瘤胃内发酵产生的丙酸浓度较高，而甲烷产量与丙酸含量呈较强的负相关关系，从而降低了甲烷排放量。因此，本试验中NDF/NFC 为1.52 的饲粮可以显著降低泌乳奶牛甲烷排放量，效果相对最优。

3.2 饲粮NDF/NFC 对泌乳后期奶牛营养物质表观消化率的影响 奶牛养分表观消化率受饲粮类型、营养水平、纤维素浓度、水分含量等多种因素影响。研究表明，饲料结构是决定其营养物质消化率的主要因素。试验采用散栏式饲喂试验奶牛，组内计算平均采食量。组内4 头试验牛可能存在的挑食现象会使奶牛摄入养分与TMR 不一致，可能会增加瘤胃pH 波动，继而影响饲粮的采食和纤维素的降解[25]。同时，TMR 养分均匀性还会受到原料添加顺序和搅拌时间等影响，这可能是本试验营养物质消化率差异较小的原因。本试验中3 组间DM、GE、OM、CP、EE、NDF、ADF、NFC 的 表 观消化率差异较小，其中低、中组EE 的表观消化率较高组分别提高了20.86% 和4.35%。本试验中不同NDF/NFC 饲粮对泌乳奶牛的表观消化率的影响不明显，但在数值上表现为随着饲粮NDF/NFC 的降低，表观消化率呈升高趋势，与以往研究结果一致。张立涛[26]研究发现，25～35 kg 和35～50 kg 绵羊的DM 营养物质消化率均随着饲粮NDF 水平的升高而显著降低。史仁煌[27]研究结果表明，奶牛DM 表观消化率随着饲粮NDF 水平的升高而降低。

3.3 饲粮NDF/NFC 对泌乳后期奶牛生产性能和饲料转化率的影响 DMI 在奶牛营养中至关重要，它决定了奶牛用于维持和生产的养分供给量。粗纤维是奶牛饲粮中必需的营养物质，在瘤胃内酵解产生乙酸和丁酸，是合成乳脂的重要原料。但是奶牛饲粮中NDF 的需要量通常有一个范围，过高会因为胃肠道的填充作用而影响DMI，所以高NDF/NFC 组的DMI 最低。研究表明，饲粮精粗比以及纤维物质含量等都是影响奶牛生产性能的重要因素。另外，饲粮精料比例增加时，挥发性脂肪酸中乙酸和丁酸含量下降，丙酸含量上升，从而使瘤胃pH 下降，纤维素降解活性下降，最终使奶牛DMI 下降；随着精料比例增加，能量水平也随之增加，奶牛采食量下降[1-2]。这也恰好能解释本试验中低组的DMI 低于中组，低、中、高 3 组的平均采食量分别为15.41、15.99、15.11 kg/d。本试验中DMI 的变化规律与产奶量的变化规律一致，与张小丽[28]的研究结果一致。

产奶量的高低主要与饲料能量水平、蛋白水平和血糖浓度等因素相关，尤其是血糖浓度可能是反刍动物最大泌乳量的主要限制性因素，血糖中葡萄糖有2 个来源：一是由瘤胃发酵产生的丙酸异生而来，二是来自于饲料蛋白生糖氨基酸的异生作用[29]。TMR 中精料含量高，瘤胃发酵模式趋向于丙酸发酵型，致使血糖浓度升高，产奶量增加；同时，精料比例高，蛋白质含量增加，生糖氨基酸浓度增加，糖原异生增加，产奶量提高。本试验中，低、中、高 3 组在试验期内的FCM 分别为14.85、18.65、14.70 kg/d，变化规律与产奶量相似，与汪水平等[30]的研究结果一致。试验奶牛初始产奶量为18.75 kg/d 左右，试验期结束后产奶量为17.93 kg/d左右，试验期前后低、中、高 3 组的产奶量较试验前分别降低了0.94、0.44、1.08 kg/d。这可能与泌乳奶牛后期由于泌乳天数增大产奶量趋于下降趋势有关。泌乳后期奶牛产奶量持续下降，采食量也开始下降。同时由于胎儿生长和胎盘增大，因此这一时期奶牛常常增重[13]。试验选用奶牛均处于泌乳后期（试验期前平均泌乳天数为242.92 d），此时奶牛正处于妊娠的最后3 个月，胎儿生长发育需要大量营养物质，造成供给泌乳的营养物质减少，这可能是造成试验期前后平均产奶量下降的主要原因。

温嘉琪等[31]研究发现，泌乳早期荷斯坦奶牛饲粮精料比例从30:70 提高到40:60 后，奶牛的DMI、乳脂率、乳蛋白率均显著增加。朱芬花等[32]研究发现，泌乳中期奶牛随着饲粮中精饲料比例增加，奶牛产奶性能随之升高，乳品质也随之改善。本试验中中组饲料转化率较高组提高了19.39%，产奶量表现为中组>低组>高组。

4 结 论

本试验条件下，饲粮NDF/NFC 能显著影响泌乳后期奶牛甲烷排放量和单位代谢体重的甲烷排放量，饲粮NDF/NFC 为1.52 组甲烷排放量较NDF/NFC 为2.10 组降低了38.87%。饲粮NDF/NFC 在1.52～2.10 对泌乳后期奶牛营养物质表观消化率无显著性影响，但随着饲粮NDF/NFC 的下降，营养物质表观消化率呈升高趋势。