孕酮对奶牛子宫内膜上皮细胞Wnt/β-catenin信号通路关键蛋白表达的影响

王 亨，王叶帆，祝启成，陶璐瑶，崔璐莹，孟 霞，朱国强，李建基*

（1.扬州大学兽医学院，江苏扬州 225009；2.江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，江苏扬州 225009）

在奶牛发情、排卵后，卵巢上排卵卵泡的体细胞发育为黄体细胞，形成黄体。受精卵完成早期发育并附植后，黄体继续发育为妊娠黄体，妊娠黄体是妊娠期所需孕酮的主要来源。已有研究表明，孕酮能够调控细胞增殖，维持黏膜上皮的生长，并刺激子宫腺生长和分泌[1]，调节乳腺细胞增殖和分化[2]，同时也参与调控乳腺肿瘤发生过程[3]，还能促进成骨细胞的增殖和分化[4]，故孕酮具有促进多种细胞增殖的作用，推测孕酮可能参与调控奶牛子宫内膜修复的过程。Wnt 信号通路广泛存在于真核生物，可调节多种生物学过程，如细胞分化、增殖等。Wnt/β-catenin 信号通路是经典的Wnt 通路，一旦被激活，β-catenin 在胞质中积聚，至一定程度即发生核转位，进而调控下游基因的转录[5]。有研究表明，孕激素可调控Wnt/β-catenin 的活性，使子宫内膜在增生和分化阶段维持相对稳定[6]。当奶牛产犊后，发生子宫内膜炎的奶牛孕酮维持在较高水平[7]，故高水平的孕酮可能抑制了奶牛子宫内膜复旧，这种影响可能涉及Wnt/β-catenin信号通路的转录。基于此，本研究通过验证不同浓度的孕酮对原代子宫内膜上皮细胞增殖的影响，研究孕酮对奶牛子宫内膜上皮细胞Wnt/β-catenin 信号通路中关键分子表达的影响，为进一步研究Wnt/β-catenin 通路在奶牛子宫内膜炎发生中的作用及其机制提供基础理论。

1 材料与方法

1.1 试验试剂 预染蛋白分子量标准（Thermo 公司，美国）；PVDF 膜（Millipore 公司，德国）；CCK-8 检测试剂盒（DOJINDO 公司，日本）；DMEM/F12 培养基和链蛋白酶（Sigma 公司，美国）；无内毒素胎牛血清（Gibco 公司，美国）；胰蛋白酶（Amresco 公司，美国）等。

1.2 原代奶牛子宫内膜上皮细胞（BEECs）的培养 无菌采集奶牛子宫，在超净台内取子宫角，用预冷的、含有双抗的PBS 反复冲洗，至液体澄清。将子宫角纵向剖开，修剪为约3 cm×3 cm 的组织块放入50 mL 无菌离心管中，加入0.1%链霉蛋白酶，至完全浸没子宫角组织，于4℃冷消化16～20 h。冷消化结束后，用灭菌手术刀轻轻刮取组织块的子宫角内膜，放置于PBS 中重悬，1 200 r/min 离心5 min 弃去上清液，再加PBS重悬细胞，以同样条件离心，重复3 次。然后加入DMEM/F12 完全培养基，吹打成细胞悬液，在37℃、5%CO2饱和湿度的细胞培养箱中培养，每1 d 换1 次细胞培养液，3～4 d 可获得原代细胞。经免疫荧光鉴定，培养所得细胞为子宫内膜上皮细胞，纯度达90%以上。

1.3 CCK-8 法检测孕酮对奶牛子宫内膜上皮细胞活力的影响 将奶牛子宫内膜上皮细胞按103cells/孔浓度接种到96 孔细胞培养板的培养孔内，待细胞增殖汇合至80%左右，更换含不同浓度孕酮（0、1、3、5 ng/mL）的培养基继续培养24 h。培养结束后，用PBS 洗涤，每孔3 次。每孔加入10 μL CCK-8 和100 μL 基础培养基预混液，放入培养箱内继续孵育4 h。在波长490 nm 处检测吸光度，每个时间点设置6 个重复，检测孕酮对奶牛子宫内膜上皮细胞活力的影响。

1.4 免疫印迹（Western blot）法检测孕酮对Wnt/β-catenin通路关键蛋白表达的影响 将奶牛子宫内膜上皮细胞以106cells/孔的比例接种于六孔细胞培养板的培养孔内，当细胞增殖汇合至80%左右时，更换基础培养基，同时加入孕酮（1、3、5 ng/mL），并设对照组，处理15 min，收集细胞。加入裂解液裂解30 min；4℃，12 000 r/min离心10 min，收集上清；BCA 法测定蛋白浓度；取10 μL 蛋白样品进行10%SDS-PAGE 电泳；采用半干法转至PVDF 膜；5% 脱脂乳室温封闭2 h；加入兔抗β-catenin、cyclin D1、c-Myc 和β-actin（CST 公司，美国），4℃孵育12～14 h；TBST 洗膜5 次；加入山羊抗兔IgG二抗（CST 公司，美国）的封闭液中，室温孵育2 h；TBST 洗膜5 次；ECL 发光液显影并拍照、分析和保存。

1.5 统计分析 数据使用SPSS 22.0 软件、One-Way ANOVA统计分析，结果以平均值±标准差表示，P＜0.05 表示差异显著，P＜0.01 表示差异极显著。

2 结果

2.1 孕酮对奶牛内膜上皮细胞活性的影响 图1 显示，添加1 ng/mL 和3 ng/mL 孕酮提高了奶牛子宫内膜上皮细胞的增殖率，5 ng/mL 孕酮降低了该细胞的增殖率，但4 组间差异均不显著。

图1 孕酮对子宫内膜上皮细胞活性的影响

2.2 孕酮对奶牛子宫内膜上皮细胞Wnt/β-catenin 信号通路关键蛋白表达的影响 如图2 所示，与对照组相比，1 ng/mL 和3 ng/mL孕酮促进了β-catenin 蛋 白 的 表 达（P＜0.01），且1 ng/mL 孕酮能够更明显地促进β-catenin蛋白的表达；而5 ng/mL 孕酮则抑制β-catenin 表达（P＜0.05）。同时，1、3 n、5 ng/mL 孕酮均明显促进了cyclin D1 蛋白表达（P＜0.01）。此外，与对照组相比，3 个剂量孕酮均明显促进了c-Myc 蛋白的表达（P＜0.01），且随着孕酮浓度的增加，5 ng/mL 孕酮组c-Myc 蛋白表达开始下降。

图2 孕酮对子宫内膜上皮细胞中Wnt/β-catenin信号通路中关键蛋白表达的影响

3 讨 论

奶牛子宫内膜由单层柱状上皮层和固有层组成，上皮细胞受激素影响，发生周期性的变化。奶牛妊娠期间，孕酮维持在较高水平，分娩后孕酮水平急剧降低，外周血孕酮水平下降至5 ng/mL 以内[1]。本研究细胞试验选用1、3、5 ng/mL 孕酮工作浓度，旨在模拟产后子宫内分泌环境。CCK-8 试验结果证明，未发现孕酮浓度对奶牛子宫内膜上皮细胞的促增殖和/或毒性作用，为后期研究工作奠定了基础。

Wnt 信号通路在细胞增殖、迁移、凋亡、抗感染、修复和分化中起到重要作用[8-10]，分为依赖于β-catenin 的经典信号通路和非依赖β-catenin 的非经典信号通路[11]。在Wnt/β-catenin 经典信号通路中，Wnt 蛋白与特异性受体卷曲蛋白（Frizzled、FRZ）和/或低密度脂蛋白受体相关蛋白（LRP5/6）结合后，激活蓬乱蛋白（Dishevelled、Dvl），抑制降解复合物糖原合成酶激酶（Glycogen Synthase Kinase-3β，GSK-3β）、轴素（Axin）、大肠腺瘤样蛋白（Adenomatouspolyposis Coli，APC）和酪蛋白激酶1α（Casein Kinase 1α，CK1α），稳定β-catenin 在胞质中的存在并逐渐累积，最后转位入核，与核内转录因子/淋巴增强因子结合（T-cell Factor/Lymphoid Enhancing Factor，TCF/LEF），调控下游靶基因的转录和表达[5]，如增殖相关基因c-myb、cyclin D1、c-myc等。本研究结果表明，1 ng/mL 和3 ng/mL 孕酮可以明显促进β-catenin蛋白的表达，同时促进下游蛋白cyclin D1、c-myc 表达水平升高，说明孕酮抑制了降解复合物的形成，使β-catenin 积聚，并转位入核，激活了下游cyclin D1、c-myc 的转录和表达，从而促进细胞增殖。有研究发现，孕酮可以上调子宫内膜癌ECC1 和HEC1A 细胞Wnt 的表达，且在子宫内膜息肉组织中Wnt 的表达明显高于对照组，证实Wnt 参与了子宫内膜的增殖[12]，这与本试验的结果相一致。同时，本研究，随着孕酮浓度升高，5 ng/mL 孕酮可以明显抑制β-catenin 的表达，且下游cyclin D1、c-myc 蛋白表达相比低剂量孕酮组出现下降，说明高浓度孕酮影响子宫内膜细胞的增殖。Wang 等[13]对月经周期子宫内膜的变化研究发现，在增殖期，雌激素水平升高诱导Wnt/β-catenin 信号通路的激活，而分泌期时，黄体分泌的孕激素可以抑制Wnt/β-catenin 信号通路，拮抗雌激素诱导的细胞增殖，促进分化。故当孕酮水平增高至一定程度，会拮抗或者抑制细胞的增殖。本研究结果可以部分解释奶牛产后发生子宫内膜炎时，常伴有持久黄体和外周血高水平孕酮，继而影响子宫复旧，导致子宫内膜炎的病程和治疗周期延长。故Wnt/β-catenin 信号通路参与子宫内膜上皮细胞增殖和产后子宫复旧过程，这一作用可能与产后高孕酮水平下发生的子宫内膜炎有关。

综上所述，Wnt/β-catenin 信号通路在低浓度孕酮下可促进奶牛子宫内膜上皮细胞增殖，但高浓度孕酮抑制了奶牛子宫内膜上皮细胞Wnt/β-catenin 信号通路关键蛋白的表达和激活，继而可能参与了奶牛产后子宫内膜炎的发生，并导致子宫复旧延迟，这为奶牛产后子宫内膜炎等相关疾病的研究提供新的思路和方法。