绵羊GTF2A1 基因多态性及其与产羔数的关联分析

狄 冉，刘秋月，王翔宇，胡文萍，夏 青，马 琳，张效生，张金龙，张仁森，潘章源，储明星

（中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，农业部动物遗传育种与繁殖重点实验室，北京 100193）

绵羊（Ovis Aries）是最早被人类驯化的家畜物种之一。绵羊为人类提供了优质肉、奶、毛和皮，因此是一个重要的家畜物种。对于绵羊而言，产羔数性状是其重要经济性状中所占权重最大的生产性状，对养羊业经济效益的贡献可以达到74%～96%。据不完全统计，产双羔所获的经济效益是产单羔的1.6 倍以上[1]。然而，大多数绵羊属一胎单羔品种，为了提高经济效益，多羔一直是人们追求的育种目标。由于羊产羔数性状的遗传力仅为0.1左右，对其选择还受到性别（限性性状）等因素的制约，故用常规育种技术改良该性状很难在短期内获得较大的遗传进展。因此，挖掘多羔关键基因、开发分子标记并用于标记辅助育种是加快遗传进展的重要举措。

产羔数是一个极其复杂的性状，受到遗传背景、营养水平、饲养环境等多种因素的影响，其中遗传因素最为重要。目前在中国绵羊品种中鉴定到的多羔基因主要是FecB[2-7]。虽然FecB基因型在一些品种例如小尾寒羊中是分离的，但在不携带FecB突变的小尾寒羊中仍然能够观测到连续的高产羔数现象，这表明我国绵羊中很可能还存在其他多羔主效基因。

全基因组选择信号分析是目前挖掘功能基因的一种重要的方法[8-14]。本团队前期通过对10 个绵羊品种（按照单、多羔进行分组）的全基因组重测序，定义Z（Fst）>5 为显著位点，筛选获得了可能与绵羊产羔数相关的候选基因——通用转录因子2A1（GTF2A1，General transcription factor 2A1）及其突变位点（7 号染色体基因组序列第89505005bp 位点，位于内含子区域），其Z（Fst）值为6.37，提示该基因可能与绵羊产羔数相关。该基因是与RNA 聚合酶Ⅱ转录引发所需的TFIID-启动子复合物相互作用的一种转录因子[15]。Lawal 等[16]利用红色原鸡作对照，分析了非洲地方鸡品种可能受选择的基因组区域，其中只有1 个区域存在注释基因（TSHR和GTF2A1），作者认为这些受选择的基因可能与鸡种适应当地的气候条件、繁殖等性状相关。Yuan 等[17]利用白来航和东乡绿壳鸡杂交产生的1 534 只F2代母鸡进行产蛋性状的GWAS 分析，发现GTF2A1和CLSPN基因影响了母鸡卵巢和子宫的功能，二者可能是产蛋的候选基因。Huang 等[18]报道GTF2A1基因在卵巢癌患者的病灶中是高度甲基化的，该基因可作为卵巢癌检测的一个分子标记。Lee 等[19]的研究结果认为GTF2A1与白血病相关的IL1B-31C 基因互作从而引发胃癌风险。然而目前未见GTF2A1与羊多羔性状有关的报道。因此，本研究以多羔和单羔的绵羊群体及产羔数存在差异的小尾寒羊大群为研究对象，利用Sequenom MassARRAY®SNP技术进行SNP 分型检测，分析GTF2A1基因上述突变位点与产羔数性状的关系，以期为绵羊高繁殖力性状的标记辅助选择提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料 具有产羔数记录的多羔绵羊品种小尾寒羊380 只（来自同一个保种场同一个群体，饲养管理条件一致，年龄均为2～3 岁），记录产羔数均为1 的绵羊群体（滩羊、苏尼特羊、萨福克羊、杜泊羊和草原型藏羊）共380 只（具体数量见表1）。饲养管理条件基本一致。

1.2 试剂及仪器 试剂：血液基因组DNA 提取试剂盒，购自天根生化科技（北京）有限公司；Complete Genotyping Reagent Kit（for MassARRAY®Compact 384），购自北京君诺德生物技术有限公司（Beijing Genenode Biotech Co,Ltd）。仪器包括基因扩增：ABI GeneAmp®9700 384 Dual；质谱点样：MassARRAY NanodispenserRS1000；质谱分析：MassARRAY Compact System。

1.3 基因组DNA 的提取 绵羊颈静脉采血1 mL，用EDTA 抗凝处理。使用天根血液DNA 试剂盒提取DNA，并进行DNA 浓度和质量检测。

1.4 采用Sequenom MassARRAY®SNP 技术进行基因分型 针对绵羊第7 号染色体基因组序列第89505005 bp位点（基于绵羊基因组版本号Oar_v3.1）设计引物组。PCR 扩增使用的上游引物序列为：ACGTTGGATGATG AAATCCATCTACCGCCC；下游引物序列为：ACGTT GGATGATCCCCATGTCCAGATCTTC。延伸引物序列为：GCATTAGTTTATTCTCCCATAACT，延伸方向是正向。上述引物由君诺德公司合成。将树脂纯化后的延伸产物移至384 孔SpectroCHIP（Sequenom）芯片上，进行MALDI-TOF-MS（基质辅助激光解析电离飞行时间质谱）反应，利用Typer 4.0 软件检测质谱峰，并根据质谱峰图判读各样本目标位点基因型。

1.5 统计分析 应用Microsoft Excel 2016 软件统计绵羊GTF2A1基因g.89505005G>A 位点的等位基因频率、基因型频率、杂合度（He）、多态信息含量（PIC）和有效等位基因数（Ne）等指标，随后进行Hardy-Weinberg 检测。使用yijkl=μ+Pj+Gk+eijkl 模型进行最小二乘方差分析，其中，yijkl 为产羔数的记录值；μ 为群体平均值；Pj 为第j 个胎次的固定效应，j=1,2,3；Gk 为该基因第k 种基因型的固定效应，k=1,2,3；eijkl为随机残差效应；误差项e 服从正态分布N（0,σ2）。用SPSS19.0 软件程序中一般线性模型进行小尾寒羊基因型与产羔表型数据关联分析，所有数据以平均值±标准误表示。

表1 被测绵羊品种及个体数量信息

2 结果与分析

2.1GTF2A1基因多态性分析 通过基因分型发现，GTF2A1基因g.89505005G>A 位点在单、多羔绵羊品种中均存在3 种基因型：AA、AG 和GG（图1）。

图1 绵羊GTF2A1 基因g.89505005G>A 位点分型结果图

根据g.89505005G>A 位点分型结果，统计单、多羔绵羊品种中该位点的基因型频率和等位基因频率，由表1 可知，绵羊g.89505005G>A 位点的基因型频率和等位基因频率在单、多羔绵羊群体间差异均达到极显著水平，且多羔群体的优势基因型为AA，优势等位基因为A；单羔群体的优势基因型为GG，优势等位基因为G。

对GTF2A1基因g.89505005G>A 位点在不同绵羊品种中的群体遗传学指标进行统计。由表2 和表3 可知，绵羊GTF2A1基因g.89505005G>A 位点在小尾寒羊、滩羊、苏尼特羊和草原藏羊中表现为中度多态（0.25≤PIC＜0.5），在杜泊羊和萨福克羊中表现为低度多态（PIC＜0.25）。卡方适合性检验结果表明，该位点在所有6 个被测品种中均处于哈代温伯格平衡状态（P>0.05）。针对该位点，滩羊、苏尼特羊和草原藏羊的遗传多样性较高，其杂合度和有效等位基因数数值高于其他3 个品种数值。

2.2GTF2A1基因g.89505005G>A 位点与小尾寒羊产羔数的关联分析 将GTF2A1基因g.89505005G>A 位点基因型与小尾寒羊第1 胎、第2 胎和第3 胎产羔数进行关联分析，表4 的统计结果表明，针对所有3 胎数据，AA 型的母羊产羔数均显著高于GG 型母羊。

3 讨 论

3.1GTF2A1基因与动物繁殖性能的关系 Lawal 等[16]利用红色原鸡为对照，分析了非洲埃塞俄比亚地区地方鸡品种可能受选择的基因组区域，发现Z（Hp）最低值（-5.8 ± 0.289）位于5 号染色体上涵盖注释基因（TSHR和GTF2A1）的区域，而且这个区域在多个地方鸡种中均存在选择信号，作者认为这些受选择的基因可能与鸡种适应当地的气候条件、繁殖等性状相关。Yuan 等[17]利用白来航和东乡绿壳鸡杂交产生的1 534 只F2代母鸡进行产蛋性状的GWAS 分析，发现与产蛋数最显著关联的区域包含了GTF2A1和STON2基因，值得注意的是两者是旁系同源基因；另外，作者推测GTF2A1和CLSPN基因通过影响母鸡卵巢和子宫的功能进一步调控产蛋性能。Huang 等[18]报道GTF2A1基因在卵巢癌患者的病灶中是高度甲基化的，该基因可作为卵巢癌检测的一个分子标记。在绵羊中，GTF2A1基因位于7号染色体上，与TSHR和STON2基因相邻，已有很多文献表明TSHR与动物繁殖性能相关[20-22]，因此这个区域值得关注。本课题前期的重测序分析结果也发现GTF2A1基因在多羔品种中受到了强烈选择，暗示这个基因可能与绵羊繁殖性能有关联。

3.2GTF2A1基因g.89505005G>A 位点多态性及其与小尾寒羊产羔数的关系 群体遗传学分析发现，GTF2A1基因g.89505005G>A 位点在小尾寒羊、滩羊、苏尼特羊和草原藏羊中表现为中度多态，在杜泊羊和萨福克羊中表现为低度多态，表明该位点在小尾寒羊、滩羊、苏尼特羊和草原藏羊中存在较强的选择潜力。另外，本课题对GTF2A1基因g.89505005G>A 位点与小尾寒羊产羔数的关联分析表明两者存在一定关联，A 等位基因可能是提高绵羊产羔数的一个潜在有效的DNA 标记。

表2 GTF2A1 基因g.89505005G>A 位点在单、多羔绵羊群体中的基因型频率和等位基因频率

表3 GTF2A1 基因g.89505005G>A 位点在不同绵羊品种中的群体遗传学分析

表4 GTF2A1 基因g.89505005G>A 位点基因型小尾寒羊产羔数的最小二乘均值及标准误

4 结 论

绵羊GTF2A1基因g.89505005G>A 位点多态性与小尾寒羊产羔数存在一定关联，A 等位基因可能是提高绵羊产羔数的一个潜在有效的DNA 标记。