Ⅱ 型草鱼呼肠孤病毒三种定量检测方法的比较与评价

曾伟伟，王英英，尹纪元，汤亚方，李莹莹，王 庆，高彩霞，2，任 燕，刘 春，石存斌

(1.中国水产科学研究院珠江水产研究所，广东省水产动物免疫技术重点实验室， 农业农村部渔药创制重点实验室，广州 510380；2.天津农学院水产学院，天津，300384)

草鱼(Ctenopharyngodonidellus)是我国最主要的淡水鱼养殖品种[1]，其产量约占整个淡水鱼养殖产业的20%。然而，由草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus，GCRV)引起的草鱼出血病的频繁爆发，严重制约了草鱼养殖业的健康发展[2]。GCRV主要危害当年的草鱼鱼苗，死亡率一般为 30%～50%，最高可达 60%～100%[3-4]，GCRV具双层衣壳，病毒粒子平均直径为60～70 nm，二十面体对称，无囊膜，基因组由11条分节段的双链RNA组成[5]。目前己报道有30多个分离株，包括854、861、873、991、 HZ08、JX09-01、 JX09-02、 GD108、109、HGDRV株等[6-11]，通过现有的分离株基因组序列信息，我国的GCRV分离株可分为3个基因型[4,6-7，12]。当前，全国各地分离到的流行株中，三类亚型均有报道，有单独感染，也有混合感染，目前导致草鱼出血病流行和暴发主要是以HZ08为代表株的GCRV-Ⅱ型为主，占了90%以上[6,13]，因此，近年来无论是基础研究还是应用研究，主要聚焦于GCRV-Ⅱ[6,14-15 ]。

GCRV-Ⅱ接种常见的鱼类细胞均不能产生致细胞病变效应(cytopathic effect，CPE)，但对鱼体的致病力则比较强[16]。由于GCRV-Ⅱ感染细胞没有CPE现象，使得对于该病毒的分离、鉴定及病毒含量的测定等都带来了一定的不便。无论是关于GCRV-Ⅱ的病原学及致病机理等基础研究，还是抗病毒药物及疫苗等防控产品研制，都涉及到如何测定该病毒的含量和病毒滴度问题。近几年来，研究人员建立了多种测定GCRV-Ⅱ病毒含量的方法，刘宝芹等[17]根据GCRV HZ08 株S7 基因保守区序列，设计了一对能特异性扩增引物和TaqMan 探针，建立了HZ08 株荧光定量PCR(quantitative PCR，qPCR)方法，用于HZ08株这一类型病毒的快速检测和定量分析。之后，黄绮雯等[18]对这一方法进行了改进，根据所有已知GCRV-Ⅱ分离株的S2基因保守区域序列，设计引物和TaqMan 探针，建立了GCRV-Ⅱ病毒qPCR方法，可用于当前所有GCRV-Ⅱ分离株的快速检测和定量分析。曾伟伟等[19]以接种GCRV-Ⅱ病毒的细胞培养板为抗原板，以免疫弱毒疫苗的草鱼血清为抗体，通过反应条件优化，建立了检测GCRV-Ⅱ病毒及其血清抗体的免疫过氧化物酶单层细胞试验(immunoperoxidase monolayer assay，IPMA)方法，该方法可用于GCRV-Ⅱ型的流行病学调查、疫苗免疫效果评价及抗原抗体检测，结合计算半数细胞感染量(50% tissue culture infective dose，TCID50)的方法，亦可用于GCRV-Ⅱ病毒滴度的测定。Wang等[20]利用抗GCRV-Ⅱ病毒S10基因编码蛋白抗体建立了间接免疫荧光试验(indirect fluorescent assay，IFA)，可用于检测GCRV Ⅱ在细胞内增殖情况和病毒滴度。qPCR、IPMA和IFA三种方法均可以用于GCRV-Ⅱ的含量测定，但目前还未有系统的比较过这三种方法的优劣，在何种情况下需要用哪一种或哪几种方法更加合适和可靠。本研究系统比较qPCR、IPMA和IFA三种方法检测和定量分析GCRV-Ⅱ的特异性、敏感性、可靠性及检测结果的相关性，为后续GCRV-Ⅱ的基础研究及产品开发过程中病毒含量测定方法的选择提供指导。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

Medium199(M199)培养基、0.25%-EDTA胰蛋白酶和胎牛血清(FBA)均为GIBCO公司产品；Premix Ex Taq(Probe qPCR)，PrimeScript RT reagent Kit(Perfect Real Time)均为大连宝生物公司产品；E.Z.N.A.Total RNA Kit为OMEGA公司产品；HRP标记的羊抗兔 IgG二抗(HRP-IgG)和 3-氨基-9-乙基咪唑(AEC)为Sigma 公司产品； 其他化学试剂为国产分析纯。ABI QuantStudio 6 Flex荧光定量PCR仪为美国应用系统公司ABI产品； PICO 17型离心机、CO2培养箱为德国Thermo公司产品；数码倒置荧光显微镜(Eclipse Ti-S)为日本尼康公司产品。

1.2 毒株、细胞和抗体

GCRV I型GZ1208株、GCRV Ⅱ型Huan1307及HZ08株、鲤春病毒血症病毒(spring viremia of carp virus，SVCV)、大口黑鲈虹彩病毒(largemouth bass ranavirus，LMBV)、锦鲤疱疹病毒(koi herpers virus，KHV)均由本实验室分离并保存，GCRV Ⅲ型HGDRV株由中国水产科学研究院长江水产研究所曾令兵研究员惠赠。草鱼吻端成纤维细胞(proboscis snout into fibers，PSF)由本实验室建立并保存，用于GCRV病毒的增殖。鲤鱼脑细胞系(common carp brain ，CCB)由德国 KHVD 参考实验室赠送，用于SVCV、LMBV和KHV的增殖。兔抗GCRV-Ⅱ阳性血清和阴性血清由本实验室制备并保存。

1.3 qPCR方法

qPCR 检测方法参照黄绮雯等[18]建立的方法，略有修改，简要步骤如下：参照试剂盒说明书进行病毒核酸提取和反转录制备cDNA；qPCR扩增引物和探针分别为：上游引物 F：5′-CCGGATACTCACCA-3′，下游引物R：5′-CGCTGATGTAATTGATGCC-3′，扩增片段大小为156 bp；TaqMan探针序列：5′FAM-GGA TCA TTT ACG TCG TAT T-TAMRA3′，长19 bp；qPCR反应体系为Premix Ex Taq(Probe qPCR)(2×)12.5 μL，PCR 上下游引物各0.5 μL(终浓度均为 0.25 μmol/L)，TaqMan探针1.0 μL(终浓度为0.25 μmol/L)，ROX Reference DyeⅡ(50×)0.25 μL，DNA或cDNA 模板2 μL，加ddH2O 至总体积为25 μL。qPCR反应程序为：预变性1个循环，95 ℃ 30 s； 扩增反应40个循环，变性 95 ℃ 5 s，60 ℃ 退火/延伸 35 s。

1.4 IPMA方法

IPMA主要方法参照曾伟伟等[19]建立的方法，略有修改，简要步骤如下：将病毒感染PSF细胞或CCB细胞，感染5 d后先后用-20 ℃预冷的甲醇固定，0.5% triton X-100的PBS(pH7.4)透化处理，5%脱脂奶粉的PBS 37 ℃封闭作用1 h或者4 ℃封闭过夜，然后加入兔抗GCRV Ⅱ 阳性血清和阴性血清，37 ℃ 湿盒孵育1 h，PBS洗3次；加入稀释的HRP标记的羊抗兔 IgG二抗(HRP-IgG)，37 ℃ 湿盒孵育1 h，PBS洗3次，加入底物ACE，室温显色 15 min，3%双氧水封闭，在倒置显微镜(Nikon，Eclipse Ti-S)下观察并拍照。

1.5 IFA方法

IFA主要方法参照Wang等[20]建立的方法，略有修改，简要步骤如下：将PSF细胞或CCB传代至共聚焦专用细胞培养板中，将病毒稀释至1.0× 103拷贝/μL后接种细胞。感染5 d后取出用-20 ℃预冷的甲醇固定，再用0.5% triton X-100的PBS透化处理；然后用5%脱脂奶粉的PBS 37 ℃封闭作用1 h或者4 ℃封闭过夜；将兔抗GCRV-Ⅱ阳性血清和阴性血清用PBS 进行1∶200倍稀释，加入各抗原孔和细胞对照孔，每孔50 μL，37 ℃ 湿盒孵育1 h，PBS洗3次；加入FITC标记的羊抗兔 IgG二抗，每孔300 μL，37 ℃ 湿盒孵育1 h，PBS洗3次；加入用PBS稀释至终浓度为5 μg/mL 的PI，室温作用10 min，进行细胞核染色处理；以50% 甘油-PBS封片镜检，在聚焦荧光显微镜下(Nikon，ECLIPSE 80i)观察结果并拍照。

1.6 三种检测方法分析灵敏度比较

将GCRV-Ⅱ HuNan1307分离株接种PSF细胞7 d后收集的细胞病毒液用qPCR[20]的方法测定其初始浓度约为8.6× 105拷贝/μL，将该细胞病毒液用灭菌的PBS(pH7.4)10倍梯度稀释至10-6次方，使病毒液浓度为8.6× 105～8.6× 10-1拷贝/μL 7个浓度梯度。分别用qPCR、IPMA和IFA三种方法对各浓度梯度的HuNan1307病毒液进行检测，每个浓度作3个重复，均取100 μL。其中IPMA和IFA同时结合TCID50法，通过 Reed and Muench计算方法[21]来测定病毒的滴度，比较三种方法检测GCRV Ⅱ的灵敏度差异。

1.7 三种检测方法分析特异性比较

将GCRV GZ1208(GCRV-I)、HuNan1307(GCRV-Ⅱ)、HZ08(GCRV-Ⅱ)和HGDRV(GCRV-Ⅲ)株病毒均稀释到1×103拷贝/μL浓度后分别感染PSF细胞，SVCV、LBMV和KHV均稀释到1×103拷贝/μL浓度后分别感染CCB细胞，感染5 d后分别用上述描述的GCRV-Ⅱ三种检方法进行检测，比较三种方法的特异性，每个样品设置3个重复，同时分别设定未感染病毒的空白细胞作为阴性对照。

1.8 三种检测方法的诊断特异性和敏感性比较

经病毒分离和PCR检测鉴定，30份疑似草鱼出血病GCRV阳性和30份GCRV阴性血清共60份临床样品，分别用qPCR、IPMA和IFA方法对这60份样品进行检测，评价这三种方法的诊断敏感性及诊断特异性。

1.9 三种方法在GCRV-Ⅱ定量上的相关性分析

为了比较qPCR、IPMA和IFA三种方法在GCRV-Ⅱ定量上的相关性，将PSF细胞传代至12孔细胞培养板中，待细胞长至单层铺满85%左右时，将HZ08和HuNan1307两株GCRV-Ⅱ分离株稀释至1.0× 103拷贝/μL后接种至PSF细胞(具体步骤见1.4)。在感染后3、7和14 d 每组分别采集3个平行重复孔的细胞病毒液。分别取等量的病毒液采用qPCR、IPMA和IFA进行定量分析，其中qPCR测定病毒基因组拷贝数，IPMA和IFA则结合TCID50试验来测定病毒的滴度。采样SPSS 22.0对三种方法的检测结果进行回归分析，建立qPCR检测的病毒拷贝数、IPMA和IFA检测的病毒TCID50两两之间的线性关系。

2 结果

2.1 三种检测方法的灵敏性分析

qPCR、IPMA和IFA三种方法分别对7个浓度梯度的GCRV-Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒HuNan1307分离株的检测结果显示，qPCR、IPMA和IFA三种方法检测的最低限分别为8.6拷贝/μL、86拷贝/μL和86拷贝/μL，qPCR的检测灵敏度比IPMA和IFA高一个数量级(见表1)。

表1 三种检测方法分析灵敏性比较结果Tab.1 The results of detection sensitivity comparison

注：其中P表示检测为GCRV-Ⅱ阳性，N表示检测为GCRV-Ⅱ阴性。

2.2 三种检测方法的特异性分析

分别用qPCR、IPMA和IFA三种方法检测GCRV HuNan1307、HZ08、GZ1208、104、SVCV、LBMV、KHV、PSF细胞和CCB细胞。结果显示，三种方法的特异性均较好，GCRV-Ⅱ型分离株GCRV HuNan1307和HZ08三种方法检测均为阳性，而其它病毒株和未感染病毒的对照细胞均为阴性(见表2)。

表2 三种方法分析特异性检测结果Tab.2 The results of analysis specificity comparison

注：其中P表示检测为GCRV-Ⅱ阳性，N表示检测为GCRV-Ⅱ阴性。

2.3 三种检测方法的诊断特异性和敏感性

分别用qPCR、IPMA和IFA三种方法对30份为GCRV阳性和30份为GCRV阴性共60份临床样品进行检测。结果表明，qPCR检测为阳性的29份，为阴性的31份，其中1份阳性样品被检测为阴性，其诊断敏感性和特异性分别为96.7%(29/30)和100%(30/30)；IPMA检测为阳性的32份，为阴性的28份，其中2份阴性样品被检测为阳性，其诊断敏感性和特异性分别为100%(30/30)和93.3%(28/30)；IFA检测为阳性的30份，为阴性的30份，其诊断敏感性和特异性分别为100%(30/30)和100%(30/30)。qPCR与IPMA方法相比，29份qPCR检测为阳性的IPMA检测到28份阳性，1份阴性，31份qPCR检测为阴性的IPMA检测到27份阴性，4份阳性， IPMA方法对qPCR方法的诊断敏感性和特异性分别为96.6%(28/29)和87.1%(27/31)；qPCR与IFA方法相比，29份qPCR检测为阳性的IFA检测到28份阳性，1份阴性，31份qPCR检测为阴性的IFA检测到29份阴性，2份阳性，IFA方法对qPCR方法的诊断敏感性和特异性分别为96.6%(28/29)和93.5%(29/31)；IPMA与IFA相比，32份IPMA检测阳性IFA检测30份阳性，2份阴性，28份IPMA检测为阴性IFA检测均为阴性，IFA对IMPA的诊断敏感性和特异性分别为93.8%(30/32)和100%(28/28)。

表3 三种检测方法对60份已知临床样品检测结果Tab.3 The results of 20 clinical specimens tested with qPCR，IPMA and IFA.

注：其中P表示检测为GCRV-Ⅱ阳性，N表示检测为GCRV-Ⅱ阴性。

2.4 三种检测方法定量结果的相关性

将HZ08和HuNan1307两株GCRV-Ⅱ分离株感染PSF细胞后，分别取感染后3、6、9、12和15 d的细胞毒液采用qPCR、IPMA和IFA进行定量分析，其中qPCR测定病毒基因组拷贝数，IPMA和IFA则结合TCID50试验测定病毒的滴度，来比较三种方法对GCRV-Ⅱ病毒定量分析的相关性。三种方法测定HZ08株感染PSF细胞后3～15 d的病毒含量分别是：qPCR为2.6×104～9.6×105拷贝/mL，IPMA为8.3×103～7.8×104TCID50/mL，IFA为9.2×103～8.6×104TCID50/mL，也就是说qPCR检测的病毒拷贝数大约比IPMA和IFA的病毒滴度值分别大8～12倍和7～11倍，相差一个数量级左右，而IPMA和IFA之间的检测结果则没有显著差异；三种方法测定HuNan1307株感染PSF细胞后3～15 d的病毒含量分别是：qPCR为6.8×105～1.7×107拷贝/mL，IPMA为5.3×104～7.7×105TCID50/mL，IFA为5.6×104～8.9×105TCID50/mL，也就是说qPCR的检测的病毒拷贝数大约比IPMA和IFA的病毒滴度值分别大13～24倍和12～22倍；而IPMA和IFA两种方法的检测结果则没有显著性差异。SPSS对三种方法的结果进行相关性分析表明，其拟合曲线分别为：Y(IPMA，TCID50/mL)=23.629X-536 174(qPCR，拷贝/mL)(R2=0.996)、Y(IFA，TCID50/mL)=20.318X-575 062(qPCR，拷贝/mL)(R2=0.995)和Y(IPMA，TCID50/mL)=1.161X-1 176(IFA，TCID50/mL)(R2=0.999)。由此可见，三种方法对于GCRV-Ⅱ病毒的定量检测结果具有较好的相关性。

表4 三种检测方法对GCRV-Ⅱ病毒定量的相关性分析Tab.4 Comparison of qPCR，IPMA and IFA for the quantitation of GCRV-Ⅱ.

3 讨论

由于GCRV-Ⅱ毒株接种常见的鱼类细胞都没有CPE，这一特性给GCRV-Ⅱ病毒的分离、鉴定、病原学研究和疫苗等防控产品的开发造成了较大的困扰。兽医上，常见无CPE产生的病毒有猪瘟病毒、猪圆环病毒等，科研人员针对这些病毒，建立了间接免疫荧光试验(IFA)、免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)、荧光定量PCR(qPCR)等多种病毒检测和病毒含量测定的方法[21-23]，应用病原学基础研究和防控产品的开发。针对GCRV-Ⅱ 病毒，科研人员也先后建立qPCR、IPMA、IFA等方法用于病毒的检测和含量测定，每种方法都有各自的优势和不足，本研究从灵敏度、特异性和相关性多方面详细比较了三种GCRV-Ⅱ检测方法的特点。

分析灵敏性测试结果表明，qPCR、IPMA和IFA三种方法检测的最低限分别为8.6 、86和86拷贝/μL，qPCR的检测灵敏度最高，比IPMA和IFA高一个数量级；三种方法检测GCRV HuNan1307和HZ08 GCRV-Ⅱ型分离株均为阳性，其它病毒株和未感染病毒的对照细胞均为阴性，表明这三种方法的分析特异性均较好。采用这三种方法对已知的临床样品进行检测，结果表明，qPCR、IPMA和IFA三种方法的诊断敏感性和特异性分别为96.7%和100%、100%和93.3%以及100%和100%。qPCR在诊断敏感性方面较差一点，也就是说qPCR方法可能存在一定的漏检概率，虽然前面通过对病毒纯培养物进行分析敏感度研究表明，qPCR的分析敏感度高于IPMA和IFA，但是检测临床组织样品时，由于组织样品成分更为复杂，qPCR方法需要先提取组织样品的总RNA再进行反转录，病毒核酸有可能被降解而导致无法检测到。与常规PCR相比，qPCR不仅能定性，更能直接定量，因只需在加样时打开一次盖子，随后完全是闭管操作，可以有效地防止扩增过程中出现交叉污染和假阳性且整个过程只需1 h左右，该技术不仅加快了检测速度也有效地提高了检测的灵敏度和准确度，特别适用于在早期病毒含量较低时检测和病原学研究过程中的定量分析。虽然IPMA在诊断特异性方面相对逊色一些，这可能与直接通过可见光肉眼观察判定结果存在一定误判有关， IPMA方法的底物显示棕褐色有较好的识别度，同一样品IPMA和IFA方法测定的TCID50结果也相近，加之IPMA操作无需昂贵的荧光显微镜，用于GCRV-Ⅱ定量分析比IFA更容易实现。IFA方法的诊断敏感度与IPMA一样，但是诊断特异性稍优于IPMA方法，两种方法整个反应原理和步骤均相似，唯一不同的是最后的结果观察阶段，IFA是通过荧光显微镜检测荧光信号来判定检测结果，有助于特异性的提高。

从前面的结果分析可以看出，qPCR、IPMA和IFA三种方法对GCRV-Ⅱ病毒的检测和定量分析结果存在一定的差异，但都保持了较好的一致性和相关性，qPCR方法测得的病毒拷贝数含量比IPMA和IFA测得的TCID50值都高出一个数量级左右。Wang等[20]比较了GCRV-Ⅱ 分离株HZ08和GCRV-I分离株JX0901 qPCR和IFA定量检测结果的相关性，也存在相似的规律，不同的是qPCR结果测得的病毒拷贝数结果比IFA测得的TCID50结果高两个数量级，这可能跟不同的病毒分离株特异性有关系。如采用qPCR和IFA测定水中感染性人腺病毒和JC多瘤病毒的含量时，两种方法的检测结果具有较好的相关性[24]，但通过qPCR测定的Tulane病毒拷贝数与通过细胞方法测得的TCID50之间却没有这种明显的相关性[25]。虽然Wang等[20]证明qPCR和IFA的结果之间存在相关性，但并没有量化他们之间的关系。牛成明等[23]将IFA测得的猪瘟兔化弱毒TCID50与兔体感染量(RID)数据进行回归分析和拟合，建立了两者间的线性数量关系。本研究也参照这个方法，在三种方法检测结果具有较好相关性的基础上，分别对qPCR测得病毒拷贝数及IPMA和IFA测得的TCID50进行回归分析，建立了两两之间相互的线性数量关系。由于qPCR测得的只是病毒核酸的含量，并不能反映具有感染性病毒的真正含量，也就是说qPCR无法直接测定病毒滴度。IPMA和IFA方法测得的TCID50，直接检测的是具有感染性的病毒含量，但这两种方法实施起来周期长，实验条件和技术都相对较高，普通实验室无法实现。本研究建立了病毒拷贝数和TCID50的线性关系后，通过qPCR方法就可以测算GCRV-Ⅱ的病毒滴度，为该病毒的滴度测定提供了一种新的选择，对于GCRV-Ⅱ的基础和应用研究均有一定的意义。